想知道“细胞周期”的检测方法吗？点它！

临床医师

原理：碘化丙啶(Propidium，简称PI)是一种双链DNA的荧光染料。碘化丙啶和双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。细胞内的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，根据DNA含量的分布情况，可以进行细胞周期的分析。
1、细胞处理：a、收集悬浮细胞5~20*10⁵于离心管中，300 g/5min 离心，弃去培养液；加入1ml 冷PBS(提前放冰上预冷) 洗涤一次， 300 g/5min 离心，弃去上清，弹散管底沉淀；
                        b、贴壁细胞弃去培养基，加入胰酶消化，待消化完全后，培养基终止消化，吹散细胞，300 g/5min 离心，弃去培养液；加入1ml 冷PBS(提前放冰上预冷)洗涤一次， 300g/5min 离心，弃去上清，弹散管底沉淀；
2、细胞固定：培加入1毫升冰浴预冷70%乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃或-20℃固定过夜。600 g/10min离心，弃去上清，加入1ml 冷的PBS，重悬细胞，600g/10min离心，弃去上清，弹散细胞，避免细胞成团；
3、RNA酶消化和PI染色： PI染色液（50μg/ml PI+50μg/ml RNAase）于500 μl体系中染色，37℃避光孵育30 min，染色过程中混匀一次。染色完成后放4℃或冰上避光保存；
4、流式检测分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光（PE通道），以低速获取细胞，低速可保证细胞之间的差异尽可能的小， 保证更高的精确度。采用适当分析软件（如 Modifit 软件）进行细胞DNA含量分析。
Tips：
1、70%的乙醇配制时需用PBS稀释，乙醇固定后可放-20℃保存一个月后染色不受影响。
2、PI的检测通道在大多数仪器上是选择PE通道（有PI专用通道的仪器除外），RNA酶消化后分析的结果更准确，因DNA和RNA都可染上PI。
实验结果：


结果解读：
1、G0/G1期细胞占总的61.2%，峰位于横座标的45.76；
2、G2/M期占13.07%，峰位于横座标的91.43，S期占 25.73%，G2/G1为2.0（即G2期为4倍体细胞，而G1期为2倍体细胞，比值为2）峰的变异系数为4.54%（好）；
3、细胞碎片为0.48%，细胞聚集体有0.06%。总的细胞数（仪器检测到的）为17525个，在细胞周期中分析的细胞数为17431个（即排除了碎片及聚集体后）；
4、CV是变异系数。一般CV越小，峰形越好，越尖锐，能控制在5%左右是比较好的结果，一般小于10%就可以认可了。

检测试剂：

品牌	产品编号	产品名称	规格
BioGems	60910-00	Propidium Iodide Solution	200 tests/ 500 tests

Tips：
1、此图是通过周期拟合软件Modifit 来分析，分析时，使用FL2-W和FL2-A显示，去除联体细胞（未显示）。
2、细胞周期流式后一般分为G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋亡峰(也称sub-G0期)。
Modifit拟合注意事项：
1、Modfit的RCS值提示拟合的曲线与真实结果的吻合程度，一般小于3是最好的，3～5较好，大于5不是很好，一般还是需要在5附近。
2、画两个点图：FSC/SSC、FL2-W/FL2-A，如果是贝克曼仪器用FL3-LIN/AUX（FL3-PEAK）第一个点图用来去除细胞碎片，第二个点图 用来去除粘连体细胞。
3、若Modifit拟合程度不好，常见的原因是细胞没有固定好，固定细胞一定要用冰的70%乙醇，加入乙醇前先将细胞弹出细胞悬液（之前洗涤有残留液体），再慢慢加入乙醇，边加入边弹管底，确保细胞充分混匀，建议-20℃固定过夜，此固定效果较好。
4、在拟合过程中有时需要手动调节G2或者G1的值，确定其中之一的值，一般G2与G1的比值为2或者接近2。

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