核酸扩增技术

会里很

核酸扩增技术分为：聚合酶链式反应(PCR)、cDNA末端快速扩增技术和等温扩增技术(ITA)三大类。


一、聚合酶链式反应技术

聚合酶链式反应中，传统PCR发表文献数最多、反转录PCR以及荧光定量PCR次之，表明这三种技术是研究中必要的技术手段。


1. 普通PCR

聚合酶链式反应PCR：体外用于扩增特定的DNA片段。
基本原理：在热循环下分别进行变性、退火和延伸，完成DNA双链的解离、引物与模板DNA的结合，最终在DNA聚合酶的作用下延伸DNA子链；在经过N个循环后，目标DNA就完成了指数级扩增。
组成成分：1.DNA模板，含有需要扩增的DNA片段；2.2个引物，决定了需要扩增的起始和终止位置；3.DNA聚合酶，复制需要扩增的区域，常用的是Taq酶；4.dNTP，用于构造新的互补链；5.含有镁离子的缓冲体系，提供化学环境。


2. 逆转录PCR

反转录PCR：是用单链模板RNA制作cDNA并完成指数扩增。
基本原理：使用逆转录酶将RNA模板转化为互补DNA（cDNA），然后将cDNA用作使用PCR进行指数扩增的模板。其中逆转录酶通常使用不耐热的禽成纤维细胞病病毒逆转录酶（AMV-RT）；DNA聚合酶和PCR使用的一样。




3. 多重PCR

多重PCR：在传统PCR的基础上的改进，在同一反应体系里加入多对特异性引物，对同一模板的不同区域扩增出多个目的DNA片段。
基本过程：选择目标基因；引物设计；核酸提取；体系优化；多重PCR扩增


4. 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR：在PCR反应中加入荧光基团，通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，实时监测扩增过程中PCR产物的量，根据实验中使用的荧光化学物质不同，分为荧光染料和荧光探针。




5. 数字化PCR

数字PCR：称作Digital PCR（dPCR)，是一种核酸分子绝对定量技术；
基本原理：将一个样本分成几十到几万份，再将其分配到不同的反应单元中，使每个微滴单元包含一个或多个拷贝的核酸分子（即DNA模板），每个单元都会对目标分子进行扩增，然后再对每个单元进行荧光信号的统计并计算。
操作流程：
1.在液滴生成仪通入待分析的PCR反应体系切割成生成 20,000 个纳升大小的液滴；2.样品中的核酸分子随机分配到大量独立的微滴中，每个微滴中含有一个或不含待检核酸分子；3.对微滴体系进行扩增反应以后，分析每个微滴的荧光信号，进行有或无的判断；4.按照泊松分布的原理，读取靶标和内参核酸的阳性微滴个数以及比例，得到靶分子的拷贝数及浓度；5.扩增的产物可以用于测序或克隆


6. 原位PCR

原位PCR技术：将PCR技术的高效扩增与原位杂交的细胞定位结合起来，从而在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定的DNA或RNA序列，基本类型为根据扩增反应中所用的dNTP或引物师是否被标记，可分为直接法和间接法。
技术流程：1.细胞固定（多聚甲醛），2.蛋白酶消化（增加细胞的透性），3.原位PCR扩增，使用引物对细胞内的RNA或DNA进行选择性扩增，4.对扩增产物进行检测。




二、RACE技术类型

RACE技术：即cDNA末端快速扩增技术，已知部分cDNA序列，基于mRNA逆转录和PCR技术获得完整的cDNA的 3‘或5’末端的分子生物学技术。简单地说，就是测定cDNA序列，获得RNA全长序列。应用的实验方向：1.构建cDNA文库2.lncRNA全长克隆3.获得抗体可变区序列4.miRNA靶基因序列验证5.已知基因一段序列，克隆旁侧序列6.获得病毒基因组
目前在RACE技术中，有商业化产品的是经典RACE、 RLM-RACE和Cap-switching RACE,市场上应用最多的是Cap-switching RACE，是基于SMART技术的拓展，生工、 Takara和诺唯赞的试剂盒都使用的该技术。


1. 经典RACE

基本流程：1.分别克隆cDNA的5′端和3′端；2.将得到的5‘末端产物和3’末端产物通过克隆连接到载体上，进行测序获得末端序列；3.测序得到的cDNA末端序列，与已知的中间序列进行拼接，就可获得cDNA全长序列。



Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide prime

2. cRACE

基本流程：1.根据mRNA上的已知区域设计特异性引物GSP，以GSP引物合成第一条cDNA链；2.利用T4连接酶将cDNA的末端连接，形成cDNA的环化结构或串联结构；在未知序列两端根据已知序列设计一对GSP进行PCR扩增，将未知序列置换到已知序列中间位置，即可得到中间是未知序列、两端是已知序列的扩增产物



cRACE: a simple method for identification of the 5' end of mRNAs

3. Adapter-Ligated RACE

基本流程：1.在得到RACE产物的基础上，体系中加入T4连接酶，利用T4连接酶将接头连接到cDNA两个末端上；2.短cDNA的退火温度低，两端接头容易发生退火，形成锅柄状结构；3.长的cDNA退火温度高，不易形成锅柄装结构，因此引物可以与接头结合，进行后续的PCR扩增。


4. RLM-RACE

基本流程：1.在RNA体系中加入牛小肠碱性磷酸酶（CAP），特异性地识别同时切除断裂mRNA 5‘端所暴露的磷酸基团；2.加入烟草酸焦磷酸酶（TAP），切除mRNA 5'端完整的帽子结构，使mRNA 5'端暴露出一个磷酸基团；3.加入RNA连接酶将接头与mRNA 5'端暴露的磷酸基团连接，而切除了磷酸基团的断裂RNA则不能与接头结合，这样便获得了5'端带有接头的完整mRNA；4.最后进行RT-PCR。



CapSelect: a highly sensitive method for 5' CAP-dependent enrichment of full-length cDNA in PCR-mediated analysis of mRNAs

5. Cap-switching RACE

基本流程：1.以Oligo dT作为逆转录引物，逆转录获得一链cDNA；2.逆转录进行至mRNA的5'帽子结构时，莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（MMLV）在新合成的cDNA的3'末端加上若干个C；3.使用5'端带有接头、3'端带有poly G结构的接头引物与cDNA 3'端的poly C互补配对，逆转录酶继续以接头为模板合成cDNA，完成接头转化，新合成的一链cDNA 3'端就含有一段接头序列；4.利用接头引物进行PCR获得RACE产物。



CapSelect: a highly sensitive method for 5' CAP-dependent enrichment of full-length cDNA in PCR-mediated analysis of mRNAs

6. RCA-RACE

基本流程：1.用oligo(dT)引物以mRNA为模板，形成一链cDNA，RNase H消化RNA链；2.利用ATP依赖性的热稳定连接酶（特异性催催化＞15nt的单链DNA的5‘磷酸基团和3’羟基连接），形成单分子环状DNA；3.使用随机引物或基因特异性引物，在φ29 DNA聚合酶的催化下进行PCR指数扩增。



phi29 DNA polymerase based rolling circle amplification of templates for DNA sequencing

三、等温扩增技术（特异性扩增）



1. 重组酶聚合酶等温扩增RPA( recombinase polymerase amplification)

RPA：由多种酶和蛋白的参与下，在恒温条件下实现核酸指数扩增的技术
技术原理：1.重组酶与引物结合，形成蛋白-DNA复合物；2.在dsDNA中寻找同源序列，引物定位，链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增；3.被替换的DNA链与SSB（单链DNA结合蛋白）结合，防止进一步被替换。



Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science

2. 环介导等温扩增LAMP(loop-mediated isothermal amplification)

针对靶基因的两端设计3对特异性引物，包括1对外引物、1对环状引物和1对内引物,技术特点：溶液中的Mg2＋和dNTPs中析出的焦磷酸离子产生白色沉淀；浑浊度既可作为反应指标。
扩增的三个阶段：茎环产生阶段，循环扩增阶段，伸长循环扩增阶段
技术原理：1.3’端内引物FIP在目标区域进行起始DNA的合成；2.外引物F3比FIP短几个nt，且浓度比FIP低，与目标DNA中的F3c互补配对并启动链置换DNA合成；3.释放FIP连接的互补链，该链可在一端形成环状结构；5’端同上；产生茎环DNA。4.茎环DNA为模板，FIP与茎环的F2c区结合，链置换合成，解离出的单链核酸也有环状结构；5.以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板，进行DNA合成延伸及链置换．形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮扩增；6.产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。



Loop-mediated isothermal amplification of DNA.

3. 依赖核酸序列性等温扩增NASBA

技术原理：1.非循环相中，引物Ⅰ与模板RNA退火后在 AMV逆转录酶的作用下合成cDNA，形成RNA一DNA杂合体；2.RNaseH降解RNA，引物Ⅱ与cDNA退火，在反转录酶作用下合成第2条DNA互补链；3.双链DNA在T7 RNA聚合酶的作用下，进行体外转录；4.RNA在反转录酶下反转录成DNA；5.进入循环相，对模板进行大量扩增。



Nucleic acid sequence-based amplification

4. 滚环核酸等温扩增RCA/RCT

技术原理：1.使用锁环探针，探针两端为同目标靶序列互补序列；2.探针识别靶序列，形成不完全闭合环；3.在DNA连接酶作用下，形成完全闭合环；4.扩增；线性扩增：正向引物识别环状模板的配对序列；在phi29 DNA聚合酶的作用下合成重复线性单链DNA序列；指数扩增：在线性扩增的基础上，添加识别目标靶序列的反向引物序列；反向引物识别单链DNA扩增产物，在DNA聚合酶作用下直接进行复制；5.产物为单链DNA/RNA。


5. 链置换等温扩增SDA (strand displacement amplification)

技术原理：1.使用含有限制性内切酶位点的目的引物扩增；2.在DNA聚合酶作用下，启动扩增，产生带有酶切位点的DNA片段（半修饰状态）；3.内切酶在其识别位点将链DNA打开缺口，DNA聚合酶延伸缺口3’端并替换下一条DNA链；4.被替换下来的DNA单链可与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链；5.反复进行，使目的序列被高效扩增。



Strand displacement amplification--an isothermal, in vitro DNA amplification technique

6. 转录介导等温扩增TMA

技术原理：1.设计一对特异性引物（靶基因），引物1是启动子引物（具有 T7 RNA聚合酶识别的启动子序列）；2.引物1与靶序列结合，进行反转录，形成 RNA/DNA杂交分子；3.反转录酶可水解 RNA/DNA杂交分子，形成单链DNA；4.引物 2与单链DNA结合，通过反转录合成双链DNA；5.T7 RNA聚合酶结合在启动子上，以DNA为模板进行转录，由一分子DNA模板可得到100-1000拷贝转录本;6.所得转录本又进入反应，作为转录介导等温核酸扩增的起始模板，重复上述步骤。


四 全长基因组测序



MDA的覆盖率高于MALBAC；在SNV和CNV的检测上两者相当。累计测序深度分布图：MDA-2的平均覆盖率为82.21%优于MDA-3的59.49% 、MALBAC的47.33%、DOP-1的5.93%；MALBAC灵敏度84.72%、特异性85.18%；MDA-2灵敏度85.86%、特异性81.18%；MDA-2在SNV和CNV检测的准确性上与MALBAC相当。
1. DOP-PCR

技术原理：1.使用由多条不同核苷酸序列组成的混合引物库，进行PCR反应（ 3’引物中间含6个随机碱基），用较低的温度（～25℃）进行退火2.缓慢升温至引物延伸温度进行引物延伸3.完成最初几个循环后，再使用较高的退火温度（～55℃）进行多循环常规PCR反应.



Single cell analysis of cancer genomes

2. MDA (Multiple Displacement Amplification)

特点：基于随机指数扩增的原因，导致不均一扩增（不同区域被扩增的倍数不一致）
技术原理：
1.恒温30℃下，随机引物和模板DNA随机结合，用Phi29 DNA聚合酶（高保真，强链置换活性）；2.链置换后，新的链又作为模板进行扩增，产生12kb～100kb的产物。



Primase-based whole genome amplification

3. MALBAC

MALBAC原理：1.用35nt引物（27nt固定通用引物＋8nt随机引物）进行链置换聚合反应，变性得到半扩增子；2.经过退火、延伸循环、 35nt引物以半扩增子为模板扩增得到全扩增子（两端互补）3.上述线性循环8-12次 4.用全扩增子进行指数PCR反应.



Single-Cell Whole-Genome Amplification and Sequencing: Methodology and Applications

4. eMDA

技术原理：1.单个细胞裂解，对基因组DNA进行片段化~10kb；2.通入微流体装置，MDA反应缓冲液与DNA片段形成油包水液滴，控制流速，确保一个液滴中包含1-2个片段；3.收集至单个管中，30℃孵育8-10h进行扩增反应；4.油滴破裂，得到扩增产物建库。



Uniform and accurate single-cell sequencing based on emulsion whole-genome amplification

5. TruePrime

特点：引物来自于模板DNA，消除了六碱基随机引物导致的扩增偏好
技术原理：1.引物合成酶TthPrimPol以单链DNA为模板合成待延伸的引物；2.基于phi29的引物延伸和链置换扩增，3.被置换下来的单链DNA作为模板合成引物继续新一轮的引物延伸和链置换扩增过程。


6. LIANTI
将Tn5转座和T7体外转录相结合
技术原理：1.LIANTI转座体准备：转座子由19bp双链转座酶结合位点和单链T7启动子环组成，将转座子和Tn5转座酶混合二聚形成LIANTI转座体；2.基因组DNA被随机片段化并由LIANTI转座子标记；3.DNA聚合酶补齐间隙，将单链T7启动子环转化为两端的双链T7启动子；4.体外转录，基因组DNA反转为RNA，3‘端自成互补结构；5.反转录，RNase消化和二链合成，获得扩增产物。



Single-cell whole-genome analyses by Linear Amplification via Transposon Insertion (LIANTI).

7 PTA

技术原理：1.以基因组DNA为模版，加入随机引物进行扩增；2.在扩增过程中终止子会随机结合到扩增产物上以终止扩增，形成250-1500bp的片段；3.Phi29聚合酶将扩增产物从模版上切下来，脱落下来的单链产物通过新的引物结合，在Phi29聚合酶的作用下延伸成双链，成为最终的PTA产物；4.引物只会结合原代DNA模版进行扩增，得到带有终止子的双链PTA产物；5.此产物即可用于后续文库构建。



Accurate genomic variant detection in single cells with primary template-directed amplification

五 反转录方式


反转录：研究过程中人为提取RNA并以其为模板人工合成DNA的过程.根据引物的不同分为三类：① Oligo(dT)  ② Random N6-N9 ③ GSP




1.  VITA单细胞全长转录组测序 （高通量）

反转录引物：5’‑下游扩增引物互补片段‑标签序列‑NNNNNN‑3’
一链cDNA序列：3’‑捕获接头-目的序列-标签序列-下游扩增引物互补片段‑5’
磁珠上的探针：上游扩增引物互补片段-条形码-UMI-捕获接头互补链（末端转移法加polydN）
工作流程：1.将待测的细胞样本制备成单细胞悬液后用固定液固定；2.使用反转录引物在固定后的单细胞的RNA上进行原位反转录反应合成cDNA第一条链；3.一链cDNA的3’尾端加捕获接头；4.通入微流控装置，磁珠上的捕获接头互补链用来捕获一链cDNA；5.在DNA聚合酶作用下合成二链cDNA；6.构建文库，上机测序。



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2. SMART扩增

2. SMART扩增

技术原理：1.设计2个特殊引物再配合MMLV反转录酶进行反转录酶；2.引物1组成：polyT 序列＋通用序列及 polyT 3’端的简并碱基；3.引物2组成：通用序列＋3个 rG 碱基；4.逆转录酶以RNA为模板在引物1下转录，合成一链cDNA（3’端有多出来的C碱基）；5.引物2与一链cDNA 3’端的C碱基互补杂交，逆转录酶起聚合作用，复制生成二链cDNA；6.通用引物进行常规PCR扩增，用于下游建库等。



Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2

3. BD Rhapsody WTA Kit（高通量）

该试剂盒用 3 ‘全转录组分析(WTA)方法筛选单细胞转录组表达情况，选择感兴趣的靶基因生成 3’靶向 mRNA 测序的定制面板，通量为1,000-1,0000个细胞。
流程为1.用Poly T进行mRNA捕获，然后对mRNA进行反转录以及模板转换，2.随机引物扩增，得到不同片段大小的DNA,磁珠纯化清除小片段，获得＞150bp的DNA片段；3.加测序接头指数扩增，磁珠纯化获得250–1000 bp大小的文库；4上机测序


4. inDrop

技术流程：1.单细胞悬液准备2.条形码水凝胶微球库准备（147，456个条形码）3.将单个细胞、条形码胶珠、裂解液和反转录试剂装载在液滴中4.在液滴中条形码胶珠破裂， UV照射引物释放，捕获mRNA，反转录5.液滴破碎，PCR扩增，文库构建.



Droplet Barcoding for Single-Cell Transcriptomics Applied to Embryonic Stem Cells

5. VASA-seq

流程：1.单细胞裂解，RNA片段化；2.末端修复，引入poly（A）；3.反转录和二链合成，生成cDNA（带有分子标签UFI和唯一barcode的序列）；4.体外转录，去除核糖体RNA；5.接头连接，反转录，PCR富集6.建库测序


6. 10×结合PacBio/Nanopore的单细胞全长转录组测序（高通量）

流程：1.制备单细胞悬液，通入10×微流控平台来制备唯一barcode包裹的液滴；2.Barcode捕获mRNA，SMART技术模板转换合成一链cDNA，生成全长cDNA；3.cDNA分成两份，一份片段化之后建库二代测序，另一份扩增建库三代测序；4.通过基因组比对进行数据分析。


7. R2C2 (10x Genomics + ONT)

R2C2方法特殊之处在于全长cDNA的环化扩增（RCA），将较短的转录组cDNA (平均长度1.2~1.5k)经滚换复制后生成长链DNA（平均长度3~5k），在对其测序时，相当于将同一来源的cDNA分子重复检测了3~5遍，以此提高测序的准确度。
流程：1）单细胞解离后，利用10x 3’ RNA kit完成细胞分选和逆转录，得到全长的cDNA;2) 部分全长cDNA用于常规二代测序；3）部分全长cDNA经过RCA扩增后构建nanopore文库，并进行测序；4）可仅利用三代数据进行下游分析。



. Highly Multiplexed Single-Cell Full-Length cDNA Sequencing of human immune cells with 10X Genomics and R2C2.

8. Smart-seq2 Vazyme/Takara

工作流程：1.用Poly T进行mRNA捕获，然后对mRNA进行反转录以及模板转换，获得一链的cDNA；2.固定的handle引物扩增，得到二链的cDNA；3.PCR富集，用于后续建库测序。


9. CEL-seq2

流程：1.oligo(dT)-T7启动子的探针捕获mRNA2.聚合酶反应，生成dsDNA3.IVT体外转录得到RNA4.用3’接头互补序列突出的随机引物进行RNA反转录5.选取目的片段大小的序列6.PCR扩增建库，双端测序


10. Smart-seq3(低通量)

技术流程：1.通过oligo-dT 钓取含有polyA尾的mRNA。2.通过模板转换引物TSO进行反转录，合成全长cDNA文库，得到A1序列。TSO序列构成: Tn5 motif 11 and a novel 11-bp tag sequence, followed by an 8-bpUMl sequence and three riboguanosines.3.通过PCR扩增，将A1序列进行扩增，扩增多条序列。4.通过Tn5-based进行序列打断，然后构建测序上机文库。5.通过UMI序列区分是否是internal reads，挑选5'带有UMI序列，构建延伸转录本。



Single-cell RNA counting at allele and isoform resolution using Smart-seq3

红叉表示等位基因之间存在遗传变异的转录本位置； 5‘片段与各种基因片段拼接，转录组重建；分析等位基因和剪切异构体的分布频率
11. Smart-seq3xpress(低通量)

流程：1.流式细胞仪分选单细胞2.通过模板转换引物TSO进行反转录，合成全长cDNA文库，得到A1序列。TSO序列构成: Tn5 motif and 11-bp tag, followed by an 8-bpUMl sequence and three riboguanosines.3.PCR预扩增（去掉了cDNA纯化、定量、片段质控的步骤）4.通过Tn5-based进行序列打断，然后构建测序上机文库。5.通过UMI序列区分是否是internal reads，挑选5'带有UMI序列，构建延伸转录本。



Scalable single-cell RNA sequencing from full transcripts with Smart-seq3xpress

12. FLASH-seq(低通量)

技术流程：1.在含有裂解液的板中单独分选出细胞2.使用一步法RT-PCR进行预扩增（在过量dCTP存在下，使用模板转换逆转录酶逆转录mRNAs）3.磁珠纯化cDNA，测量浓度和片段4.用Tn5转座酶标记cDNA5.PCR扩增，加入条形码测序接头6.汇集所有孔内样本，制备上机文库



. Fast and highly sensitive full-length single-cell RNA sequencing using FLASH-seq

13. SUPeR-seq(低通量)

流程：1、显微镜下选取单细胞（文章筛选110个细胞）；2、裂解单细胞，释放总RNA，加入逆转录酶和引物(AnchorX-T15N6)，随机引物与RNA结合后反转录成第一链cDNA，然后用ExoSAP-IT消化未反应的引物;3、然后通过末端脱氧核苷酸转移酶(Invitrogen)将poly(A)尾分别添加到第1链cDNA的3个末端，dATP和ddATP的最终浓度分别为3 mM和30 μM。4、另一个锚定序列(AnchorY- t24)的poly(T)引物合成第二链cDNA（添加PCR Handle）。5、然后用PCR扩增这些cDNA;6、将PCR产品打断200bp左右，建库7、上机测序。



Single-cell RNA-seq transcriptome analysis of linear and circular RNAs in mouse preimplantation embryos

14. MATQ-seq(低通量)

与SMART-seq相比，MATQ-seq提供了全基因体覆盖，可以检测总RNA，包括非编码和非聚腺苷化RNA。此外，MATQ- seq利用分子条形码（UMI）策略消除了PCR偏倚。
流程：1.用显微镜分离单细胞（文章筛选90个细胞）2.细胞裂解，释放总RNA；3.用MALBAC引物及MALBAC- dT引物进行反转录一链合成；4.消解没有结合到mRNA的引物；5.消解RNA；（溶液中只剩反转录cDNA一链）6.在cDNA一链上加C；7.模板转换生成cDNA二链；8.PCR扩增，文库构建；9.上机测序



Effective detection of variation in single-cell transcriptomes using MATQ-seq

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