流式细胞仪分析

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当细胞悬浮液通过流式细胞仪时，鞘液通过流体动力学聚焦细胞，使它们以单行形式通过小喷嘴。由此产生的微笑流体流每次将一个细胞带过激光，如图1所示



图1.流式细胞仪图概述了流式细胞仪。鞘液聚焦细胞悬浮液，使细胞一次通过激光束。检测向前和侧向散射光以及染色细胞发出的荧光。
多色流式细胞仪



图2.基本多色流式细胞术技术概述
当样品被引入多色流式细胞仪流动室时，它进入流体系统并在称为流体动力学聚焦的过程中分离成单个细胞。流体动力聚焦使用受控的流体流动将样品聚焦成狭窄的直径，导致细胞分离并排列成单列。
当每个细胞通过激光时，一起将其记录为一个事件。对于每个事件，随后记录前向散射和侧向散射。如果细胞被荧光标记，激光会激发萤光团，并且发射的光被收集为荧光强度。
对于检测萤光团发射的特定波长的仪器，发射的光穿过一系列镜子和滤光片，直到到达适当的检测器。检测器称为光电倍增管（PMT），仅检测特定波长的荧光。
滤光片阻挡某些波长并让其他波长通过。当以一定角度放置时，二项色滤光片充当镜子，允许特定波长通过，而其他波长则被反射。二项色滤光片的类型和顺序允许同时检测多个信号。
前向和侧向散射光的测量
所有穿过光束的细胞活颗粒都会散射激光，由光束前面的检测器测量为前向散射（FS），以及从检测器到光束侧面测量的侧向散射（SS）（图3）。



图3.当绿色激光照向细胞时发生散射。细胞散射光的方向与细胞大小和力度相关。
FS与细胞大小相关，SS与细胞粒度成正比。因此，细胞群通常可以根据其大小和粒度的差异来区分（图4）。



图4. a）流式细胞术测量激光的前向散射（FS）和侧向散射（SS），反映细胞大小和粒度。b）典型图显示如何根据FS和SS数据区分不同的免疫细胞类型。
一个有用的例子实在流式细胞仪上运行血液样本。
较大且颗粒较多的粒细胞被视为具有较高SS和FS的大量细胞
单核细胞是大细胞，但颗粒较小，因此它们会产生具有高FS但较低SS的单独群体。
较小的淋巴细胞和淋巴母细胞形成独立的群体，FS较低，并且SS也较低，因为他们不是颗粒细胞
因此，这些细胞可以仅根据其FS和SS分为不同的群体（图5）。



图5.流式细胞术图：FS与SS的点图。每个点代表流式细胞仪分析的单个细胞。细胞大小和粒度的差异决定可不同细胞群的特征位置。
散射光和荧光的测量
除了测量样品中所有细胞或颗粒的前向和侧向散射光外，流式细胞仪内的荧光检测器还测量阳性染色的细胞或颗粒发出的荧光。例如，可以用针对特定蛋白质的荧光标记抗体或结合特定结构（例如DNA）的荧光配体对它们进行染色。当被具有相应激发波长的激光激发时，这些萤光团（或荧光染料）会发光。
来自染色细胞的FS和SS光和荧光被分成规定的波长，并通过流式细胞仪内的一组滤光片和镜子引导至称为光电倍增管（PMT）的传感器。PMT将光子的能量转换为电信号（电压）。荧光经过过滤，以便每个传感器仅检测特定波长的荧光。
在图6所示的示例中，异硫氰酸荧光素（FITC）通道PMT将检测FITC发出的波长约为519nm的光。藻红蛋白（PE）通道PMT将检测PE发出的575nm波长的光。每个PMT还将检测样品中存在的任何其他物质，其发射的光的波长与其所检测的荧光团相似。



图6. 用荧光抗体染色的细胞经过激光。
流式细胞仪中使用各种滤光片将正确波长的光子引导至每个PMT（图7）.短通（SP）滤光片允许传输低于指定波长的光子，而长通（LP）滤光片允许传输高于指定波长的光子。
二向色滤光片/反射镜（例如二向色LP反射镜）与光束成45°角防止，并重定向而不是完全阻挡不需要的波长的光。例如，高于特定波长的光子在长通二向色滤光片中直接向前传输，而低于特定波长的光子以90°角反射。



图7.流式细胞仪中的带通（BP）、短通（SP）和二向色滤光片。
参考文献
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2.Holmberg-Thyden S, Gronbaek K, Gang AO, et al. A user’s guide to multicolor flow cytometry panels for comprehensive immune profiling. Analytical Biochemistry 2021;627:114210
3.Maciorowski Z, Chattopadhyay PK, Jain P. Basic Multicolor Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol 2017;117:5.4.1-5.4.38

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