当代谢研究遇上流式细胞术

青草

“流式之父”Mack Fulwyler于1965年发明了现代细胞分选仪(Cell sorter)，随后他推动了流式细胞术与免疫学的结合，这种高通量的方法使得免疫学研究如虎添翼。随着流式细胞仪及各种细胞染色技术的发展，流式细胞术在代谢领域也大放异彩，这一期我们整理了 Bio-protocol 杂志上发表的关于流式细胞术在代谢研究中的应用的文章，希望能给大家的研究带来便利。


1. Lysosome Targeting RedGreen-assay: Selective Autophagy Sensing Assay for Mammalian Cells
来自加拿大的研究人员为我们描述了一种借助串联荧光蛋白观察和定量自噬的可靠方法，这篇文章描述的方法最早发表在 Journal of Cell Biology杂志上，题目是Deubiquitinating enzyme USP30 maintains basal peroxisome abundance by regulating pexophagy。
自噬过程是一种必不可少的细胞机制，通过该机制可以去除功能失调的细胞器（如内质网、过氧化物酶体和线粒体、蛋白质聚集体和细菌等）。由于自噬是一个极其动态的过程，研究人员不断开发出了各种工具来研究该过程的各个步骤。在日本科学家Noboru Mizushima首先克隆了自噬标志物LC3之后，围绕着LC3的一系列指征方法为研究人员广泛应用。其中RFP-GFP-LC3就是一个经典的自噬流指示物，它利用了溶酶体的酸性pH值(~4.6)可以淬灭GFP(pKa~6)荧光而不影响RFP(pKa=4.5)荧光的这一特性，使得RFP-GFP-LC3到达自噬性溶酶体（autolysosome）后，GFP信号被淬灭，RFP信号占主导地位，这一动态过程就很容易量化并且适合高通量实验。此外，通过用细胞器特异的靶向序列标记GFP-RFP串联荧光蛋白，可用于测量各种自噬底物。
本文就是利用这一原理，通过标记串联荧光团到过氧化物酶体定位的PEX26蛋白的跨膜结构域，使其能够局限于过氧化物酶体膜的细胞质面，可用于特异研究自噬的最后阶段，即货物定位到自噬溶酶体阶段。该方法的优点是不光可以测量一般自噬过程，还可以用于测量各种形式的选择性自噬。



溶酶体靶向的红绿测定示意图

原文链接：Lysosome Targeting RedGreen-assay: Selective Autophagy Sensing Assay for Mammalian Cells  溶酶体靶向红绿试验


2. BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry
BODIPY 493/503是一种非常出色的中性脂质染料，在脂滴研究中被广泛应用。来自宾夕法尼亚大学的研究人员在这个方案中，使用BODIPY 493/503用于流式细胞术定量中性脂质含量和显微镜观察脂滴，该方法最初以题为HIF2α-Dependent Lipid Storage Promotes Endoplasmic Reticulum Homeostasis in Clear-Cell Renal Cell Carcinoma发表在 Cancer Discovery 上。
脂滴是普遍存在的动态细胞器，是甘油三酯和胆固醇酯等中性脂质的储存库。脂质物种进出脂滴的运动影响多种细胞过程，如能量稳态、脂质信号和膜稳态。例如，中性脂质储存会在脂质合成或摄取增加时增强；另一方面，细胞外信号可促进中性脂滴内脂类物质的释放。目前采用BODIPY 493/503等脂质染料对脂滴染色已经是相关研究的人员的标准操作之一了，在这篇文章中作者给出了一个标准的染色流程，可以供大家参考。



细胞内中性脂滴的定量和可视化

原文链接：BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry  显微镜观察BODIPY 493/503 染色中性脂滴以及用流式细胞仪量化


3. Flow Cytometric Quantification of Fatty Acid Uptake by Mycobacterium tuberculosis in Macrophages
来自康奈尔大学的研究人员描述了一种量化细胞内杆菌对脂肪酸摄取的新方法，这篇文章描述的方法最早发表在 eLife杂志上，题目为Rv3723/LucA coordinates fatty acid and cholesterol uptake in Mycobacterium tuberculosis。
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)是人类结核病的病原体，它非常适合在人类宿主内生存。其可以吸收代谢宿主衍生的脂质（脂肪酸和胆固醇）的能力被认为是该细菌能够长期在宿主体内存在的原因。因此，阐明Mtb中营养吸收和代谢所涉及的机制将有助于我们更好地了解宿主/病原体相互作用，并可能为新药物的研发提供思路。然而，直到本文发表前，还没有可靠的方法来量化在宿主细胞感染期间细菌对脂肪酸的摄取。
在这里，作者描述了一种量化细胞内杆菌对脂肪酸摄取的新方法。作者首先利用组成型表达mCherry的Mtb感染巨噬细胞，然后在培养基中加入Bodipy-palmitate标记它们。接着作者分离含有mtb的吞噬体，并用洗涤剂破坏吞噬体。在大量清洗后，分离的细菌用流式细胞仪分析，以确定细菌的bodipy-棕榈酸盐信号水平。这种方法可以用于高通量的基因筛选，可以作为进一步了解结核分枝杆菌和其他胞内病原体在宿主细胞感染过程中脂肪酸摄入机制的工具。



用于量化巨噬细胞感染期间结核分枝杆菌摄取脂肪酸的方法概述

原文链接：Flow Cytometric Quantification of Fatty Acid Uptake by Mycobacterium tuberculosis in Macrophages  流式细胞术定量测定巨噬细胞中结核分枝杆菌对脂肪酸的摄取
流式细胞术的应用还有很多，很多发表 Bio-protocol杂志上的经典方法重复性良好，实用性很高，我们将陆续整理出来供作者参考。


Bio-protocol 简介

Bio-protocol于2011年在斯坦福大学创建, 致力于搭建全球权威的、高质量的生物实验方案分享平台，以助力科学发现。Bio-protocol期刊是Bio-protocol旗下的一份同行评审的国际学术期刊，发表高质量的生命科学实验方案，旨在提高科研的可重复性。至今，Bio-protocol已发表了来自全球上万名优秀科研工作者（包括多名诺贝尔奖获得者）的5000多篇实验方案，并且同 Science、eLife等12家国际权威科学杂志建立长期合作关系，共同促进生命科学研究的可重复性。2019年Bio-protocol期刊已被PubMed Central，ESCI收录。

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