零帧起步，不走弯路，流式细胞术从0到1真的不难

千姿百态

流式细胞术（Flow Cytometry, FC）是一种以流式细胞仪为检测手段，在悬浮液中快速分析和分类单个细胞或细胞结构，并加以定量的技术。结合了光学和电子测量手段，通过对细胞进行荧光染色，实现了对细胞特征，如大小、形状和荧光信号的即时量化。流式细胞术还可以结合细胞分选仪通过荧光激活细胞分选（Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS）精准的从群体种分离特定类型的细胞或细胞器，极大地推动了细胞生物学、免疫学以及临床诊断等多个领域的进步。
流式细胞仪分类：
1. 传统流式细胞仪：


2. 质谱流式细胞仪


3. 光谱流式细胞仪


下面先以最常用的传统流式细胞仪进行介绍和了解：
市面上常见的流式细胞仪厂家有：BD、Beckman、Agilent、美天旎等
BD常见仪器：


Beckman常见仪器：


Agilent常见仪器：


美天旎常见仪器：


接下来让我们了解一下流式细胞仪的工作原理，仪器一般包括四个系统：
1. 流动室与液流系统
在流式细胞仪中，流动室扮演着核心角色。样品（通常是悬浮于液体中的细胞）通过高压泵被推送至喷嘴，形成一股稳定的液流。在流动室内，样品被精确地约束成一条狭窄且均匀的液流束，即所谓的鞘液流（sheath flow）。这种设计确保了每个细胞能够逐一、有序地通过检测点，避免了细胞之间的相互干扰，从而实现对细胞的精确测量。
2. 光源与光学系统
流式细胞仪的光源通常为激光器，能够发射出高强度的单色光束。当液流束穿过光源时，其中的细胞或颗粒会被光束照射，进而产生散射光，或者荧光标记物会发射出荧光。光学系统由透镜、滤光片和反射镜组成，其作用是收集这些散射光或荧光信号，并将它们精准地引导至对应的检测器。通过精确调整光学元件的位置和角度，可以有效控制信号的方向和强度，从而显著提升数据的质量和分辨率。
3. 信号收集与光电转换系统
在光学系统捕捉到光信号之后，这些信号会被光电倍增管（PMTs）、雪崩光电二极管（APDs）或其他类型的光电探测器接收，并被迅速转换为电信号。接下来，这些电信号经过放大和数字化处理，以便计算机能够进行进一步的分析。不同类型信号的差异反映了细胞的不同特征，比如细胞的大小、形状，以及细胞表面或内部标记物的存在情况。
4. 分选系统
在具备分选功能的流式细胞仪中，检测完成后，仪器能够根据特定参数（例如荧光强度）自动识别并分离出目标细胞。这一分选过程通过在目标液滴上施加电荷来实现。当这些带电液滴通过静电偏转板时，会依据其电荷的正负和强度被引导至不同的容器中，从而完成对细胞的精确分选。


实验步骤：
1. 细胞悬液的制备与标记
实验初始阶段，需从组织切片或细胞培养皿中获取细胞，并将其处理成均匀的单细胞悬浮液。此过程常借助酶消化、机械分离或轻柔振荡等手段，确保细胞充分分散、避免聚集，以维持良好的流动性。接下来进行荧光标记，这是流式细胞仪识别和分析不同细胞类型或细胞组分的关键步骤。特异性荧光染料或抗体被用于标记细胞，而标记物的选择则需基于目标抗原的特异性、细胞类型以及预期荧光信号强度等因素综合考量，因为这一步骤直接关系到后续分析结果的准确性。
2. 液流聚焦与激光扫描
细胞悬液经由一个精密的压力调控系统，被精确地引导至流式细胞仪的核心区域——微小的喷嘴。在喷嘴处，受压力作用，细胞悬液被拉伸成一条细长的液柱，形成所谓的“液流鞘层”结构。在此过程中，外部缓冲液被加压，包裹住中央的细胞悬液，使其沿中心轴线呈直线流动，从而有效避免细胞间的碰撞和聚集。当液流中的细胞依次通过喷嘴下方的激光照射点时，它们会遇到一束高度聚焦且频率稳定的激光束。激光的能量足以激发细胞内携带的荧光标记物，使其发出特异性的荧光信号。同时，细胞还会产生两种不同角度的散射光信号：一种反映细胞的物理尺寸，另一种则揭示细胞内部结构的复杂性。这些信号被周围的光电倍增管（PMTs）或雪崩光电二极管（APDs）等高灵敏度传感器捕捉。


3. 数据采集与分析
当光电传感器捕捉到散射光和荧光信号后，会立即将这些模拟信号转换为数字信息，以便计算机进行后续处理。这一过程包括对信号强度的精确量化、噪声的滤除以及基线的校准，从而确保每条信号曲线的清晰度和准确性。转换后的数据文件被导入专业的流式细胞仪分析软件，用于进行深入的统计分析。该软件不仅能够计算细胞的数量、比例、平均荧光强度等基础参数，还具备高级功能，如门控分析和双变量散点图绘制。这些功能帮助研究人员从海量数据中提取有价值的信息。通过设置不同的门限值，软件可以自动筛选出符合特定标准的细胞亚群，实现细胞亚群的精细化鉴别和分类。


4. 细胞分选与回收
除了强大的分析功能外，部分高端流式细胞仪还配备了先进的细胞分选装置，能够在检测过程中实时分离出目标细胞。这一功能的实现依赖于静电场或声波振动产生的力，这些力可以精确切割液流中的细胞“液滴”，并将含有特定标记的细胞液滴引导至预设的收集容器中。细胞分选的效率和纯度主要取决于液滴分割的速度与精度，以及分选阈值的合理设定。
流式细胞术特点：
1. 研究对象为生物颗粒，如细胞、染色体、微生物、人工合成微球等；
2. 快速、准确、高通量检测；
3. 多参数、多荧光分析，对细胞特性的识别、计数更为准确；
4. 定性或定量分析细胞；
5. 分选特定性状或功能的细胞
抗体及荧光素使用原则：
流式细胞术依赖于特异性抗体来识别和标记细胞上的特定抗原，进而通过荧光染料的发射光谱来进行细胞表型分析和分选。正确选择抗体和荧光素对于获得高质量的数据至关重要。
1. 确定抗体基本信息
检测目标: 明确是要检测细胞表面还是细胞内的分子。
物种匹配: 选取针对目标物种特异性的抗体。
适用性确认: 确认抗体说明书或数据库中表明其可用于流式细胞术。
2. 熟悉所用仪器参数配置
激光器规格: 了解你的流式细胞仪配备哪些激光器，比如405nm, 488nm, 或者635nm。
滤光片设置: 根据滤光片设定，确定可以同时检测的最大指标数量。
仪器兼容性: 注意不同仪器对相同荧光剂检测通道的潜在差异。
3. 荧光素的选择策略
强度考量: 对于低表达或难区分群体，优先选择亮度高的荧光素如PE或APC；而对于高表达特征，则可以选择FITC这类较弱但普遍的荧光素。
耦合荧光素：是一类组合式的荧光素，通常由两种不同的荧光分子偶联结合而成。耦合荧光素能够提供更加宽广的荧光发射光谱，从而为多色染色增加了更多的选择。
荧光排序参考: PE > APC > PE-cy5 > Cy5 > PerCP-Cy5.5 > FITC。
4. 多色荧光标记技巧
通道分配: 基于仪器能力和检测需求，合理安排荧光素与检测通道的对应关系。
光谱兼容性: 尽量避免使用光谱重叠严重的荧光素组合，以免增加补偿调节难度。
5. 同型对照的重要性
背景排除: 使用与实验抗体同种、同亚型、同荧光标记的对照抗体，以评估非特异性结合带来的背景染色。如实验抗体为APC anti-human CD3 Antibody，种属来源为Mouse IgG2a, κ，那么同型对照应选择APC Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl
一致性保证: 确保对照抗体与实验抗体在种类、荧光标记及用量上一致，以维持数据可靠性。
6. 直接法vs间接法染色决策
直接法优势: 快速简便，减少处理步骤，适合多参数同时分析。
间接法优点: 提供更强信号放大效果，尤其适用于低表达靶点的检测；灵活性更大，利于抗体初筛。

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