wb 常用内参是什么？

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wb 常用内参是什么？
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清风寡欲

1、什么是内参？

内参是Western Blot实验中用于标准化和校正实验误差的一类蛋白质。它们通常是在不同组织和细胞中表达相对恒定的蛋白质，由管家基因编码，常用作检测目的蛋白表达水平变化时的参照物。
2、内参在WB中的作用是什么？

校正实验误差：内参用于校正蛋白质定量和上样过程中的实验误差，以保证实验结果的准确性。由于不同的样品在蛋白质提取、定量、上样等步骤中可能存在操作误差，使用内参可以对这些误差进行校正。
半定量分析：通过比较内参和目标蛋白的信号强度，可以对实验结果进行半定量分析。如果样品蛋白量有限，只够进行一次电泳转膜实验时，分别检测样品的内参量和目的蛋白量，然后将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得到内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，用此数值进行样品间的比较和分析。
作为空白对照：内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全，以及整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。
确保实验结果的可比性：在比较不同条件下或不同组织中目的蛋白表达量的相对多少时，内参提供了一个参照标准，确保了实验结果的可比性。
3、常见的WB内参有哪些？

β-Actin：β-肌动蛋白是一种细胞骨架蛋白，分子量42KDa左右，广泛分布于各种组织中，表达量丰富且相对恒定。它通常用作总蛋白的内参，尤其是在非肌肉组织中。然而，需要注意的是，β-Actin在某些特定组织（如心肌）中的表达量可能较低，因此并非在所有情况下都适用。此外，不同的β-Actin亚型在不同组织中的分布也有所不同，选择抗体时需考虑这一点。




大鼠脑裂解物20μg



人结肠癌组织



Hela细胞

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GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）：36kD左右，GAPDH是一种广泛表达的蛋白，适用于多种细胞类型。然而，在某些条件下，如缺氧或糖尿病，GAPDH的表达可能会受到影响，因此需要根据实验条件谨慎选择。



1: HeLa whole cell lysate 20ug Lane
2: THP-1 whole cell lysate 20ug Lane
3: MCF7 whole cell lysate 20ug Lane
4: NIH/3T3 whole cell lysate 20ug Lane
5: mouse spleen lysate 20ug Lane
6: C6 whole cell lysate 20ug Lane
7: rat spleen lysate 20ug
abs132004 Rabbit anti-GAPDH Polyclonal Antibody
β-Tubulin：55kDa左右，β-Tubulin是微管蛋白的一种，参与构成细胞骨架。由于其在细胞中的稳定表达，尤其用于检测细胞骨架蛋白时。β-Tubulin的表达在多种细胞类型中相对恒定，但同样需要考虑特定条件下的表达变化，如在凋亡细胞中。




Hela细胞全裂解物



大鼠肾组织



NIH3T3细胞

abs171597 Rabbit anti-β-Tubulin Monoclonal Antibody
除了以上介绍的内参以外，还有α-Tubulin、Hsp90等等，每个内参的分子量及适用情况不一样，建议选择之前做好功课。
4、如何挑选合适的内参，需要考虑哪些因素？

目的蛋白分子量：内参蛋白的分子量应与目标蛋白的分子量相差至少5kDa以上，以确保在凝胶电泳和Western Blot中能够清晰地区分目标蛋白和内参的条带。
样本种属来源：不同种属的样本可能需要选择不同的内参蛋白。例如，哺乳动物的组织或细胞样本常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH等，而植物样本可能选择plant actin、Rubisco等作为内参。
细胞定位：根据目标蛋白的亚细胞定位选择相应的内参。例如，如果是检测全细胞或细胞质蛋白，可以选择β-actin、β-tubulin、GAPDH等；如果是核蛋白，则可能选择Lamin B、Histone H3等作为内参。
实验环境：内参的选择还需要考虑实际的实验环境和样品的前处理。在某些特殊条件下，一些内参蛋白的表达可能会发生变化，从而影响其作为内参的稳定性和可靠性。例如，在缺氧或糖尿病等条件下，GAPDH的表达可能会增加，因此可能不适合作为内参。
组织特异性：不同的组织可能需要选择不同的内参。例如，肌肉组织中可能需要选择特定的肌动蛋白亚型作为内参，而在非肌肉组织中则可能选择β-actin等。
5、内参抗体和目标抗体如何孵育？

顺序孵育：在检测完目标蛋白后，使用strip缓冲液洗掉膜上的抗体，然后重新进行内参蛋白的抗体温育和显色检测。这种方法需要在两次孵育过程中使用同一张膜。
双膜法：在蛋白转膜后，根据预染的蛋白质Marker的大小将膜剪成大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行孵育和显色。
同时孵育（如果分子量相差较大）：如果目的蛋白的分子量与内参蛋白的分子量相差较大，可以在转膜后的同一张膜上同时进行两种抗体的孵育。由于条带位置的差异，可以在同一张膜上分别检测内参和目标蛋白。
使用标记内参抗体：有些实验室使用预先标记有酶（如HRP）的内参抗体，这样可以在二抗孵育时加入这种标记内参抗体，按照正常操作进行显色。
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货号	产品名称	规格
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长长的路

蛋白质印迹（Western blot，WB）是一种已经实践了三十多年的技术，最初是作为检测复杂样品中靶标蛋白质的一种手段，科研工作中多用于研究基因表达水平，或蛋白与蛋白间的相互作用。再进行WB实验时，除了掌握必要的实验技巧外，还需要选择好内参基因，即在大多数情况下表达都相对稳定的基因，以这个基因作为“标尺”，衡量我们的靶基因的表达情况。
在日常实验设计时，我们想要明确我们研究的靶基因在设定的特定条件下的表达情况，必须引入内参基因，通过选择合适的内参基因，对比试验组和对照组中靶基因与内参基因表达量的相对差异，确认我们研究的的意义。
但大量研究表明，许多常用的内参基因在不同组织细胞、不同实验条件、不同生理状态下表达水平有较大差异，迄今尚未发现普遍适用于所有条件的内参基因[1]。因此，在特定样本集合中选择恰当的内参基因至关重要。
本文将从内参基因的定义、特点、作用、常用的内参基因及如何选择等方面进行介绍，希望可以为大家的科研项目研究提供帮助。
01 内参基因是什么

内参基因在各细胞和组织中的表达量比较恒定，在评价基因的表达水平变化时常用它们来做参照物，内参基因指在不同处理因素作用下均不会发生表达量改变的基因。最常见的内参基因是内源性参照基因，也叫管家基因。
管家基因：又称持家基因(house-keeping genes)，生物体各类细胞中都表达，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的蛋白质编码的基因。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等。管家基因是为维持细胞基本生命活动所需而时刻都在表达的基因。管家基因表达水平受环境因素影响较小，而是在个体各个生长阶段的大多数、或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。它的表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。管家基因高度保守并且在大多数情况下持续表达。
02 内参基因特点

理想的内参基因应具备以下特点：
① 稳定性：在各组织细胞中表达相对稳定，无显著差别；且不受实验处理的影响。
② 普遍性：在各组织细胞中广泛存在，方便用于蛋白测试。
③ 易检测性：表达丰度较高，且与目的基因的表达量具有可比性，易于检测；
④ 不易受干扰：表达水平不受任何内源性或外源性因素的影响。
03 内参基因作用

① 标准化蛋白样品上样量。内参蛋白是细胞中稳定表达且量相对恒定的蛋白质。通过对比每个样品孔的内参蛋白量，可直观评价每个样品中蛋白质上样量是否一致，保证了实验数据的可靠性。
② 矫正实验误差。在Western Blot实验过程中，从样品制备、蛋白质提取、蛋白电泳到转膜、抗体孵育等多个步骤中均可能引入技术误差。内参蛋白可以用来指示这些操作步骤中可能出现的误差情况，确保实验数据的科学性。
③ 蛋白的相对定量分析。在做Western Blot实验结果分析时，通常会将目的蛋白的信号强度和内参蛋白的信号强度的比值来评价目的蛋白的相对表达量。这种比值计算方法能够排除因实验条件、实验处理等带来误差因素的影响，更准确地反映目的蛋白在不同样品中的相对表达水平。
04 有哪些常用的内参基因？

目前在实验中比较常用的内参基因主要为GAPDH（36KDa）、β-actin（42KDa）、β-tubulin（50-55KDa）等，详细如表1所示。



05 如何选择最佳的内参基因？

正确的选择内参基因，很大程度上依赖所研究的细胞或组织，不同的试验需要寻找适合各自试验体系的特异性稳定表达的内参基因。然而，合适内参基因的选择，需要在各种类型的细胞或组织和各种试验条件下进行比较选择。
具体应该如何从项目的源来来选择内参基因呢？
① 确认靶蛋白后，先通过权威的蛋白质数据库Uniprot（https://www.uniprot.org/）查找靶蛋白信息，关注蛋白的细胞亚定位（确定选择提取细胞的总蛋白、膜蛋白、胞质蛋白、核蛋白还是细胞器蛋白）和分子量（区分内参蛋白的分子量）。
② 根据查到的信息，确定要提取的蛋白类型（总、膜、胞质、核还是细胞器），按表1建议选择内参，需要注意的是，某些病理生理状态下，有些管家基因的表达会受到明显干扰。
③ 选择与待测蛋白在生物学功能上无关的蛋白作为内参。
④ 内参的分子量与目标蛋白质不同，易于区分。一般建议分子量相差5KDa以上。
⑤ 选择与样本蛋白定位一致，或包含与样本蛋白的样品。如选用TBP作为内参，需要样本还有DNA。

附内参基因参考查询数据库：Internal Control Genes Database (ICG) https://ngdc.cncb.ac.cn/icg/
<hr/>

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<hr/>参考文献
1. Meyer, S.U., M.W. Pfaffl, and S.E. Ulbrich, Normalization strategies for microRNA profiling experiments: a 'normal' way to a hidden layer of complexity? Biotechnol Lett, 2010. 32(12): p. 1777-88.
2. Meng, Q., B.X. Li, and X. Xiao,Toward Developing Chemical Modulators of Hsp60 as Potential Therapeutics. Frontiers in Molecular Biosciences, 2018.5.
注 文中图片等均来自网络，如有侵权请联系删除。

卡卡

①β-actin，分子量43
②gapdh，分子量36
③vinculin，分子量117
④β-tubulin，分子量因亚型不同而有所区别
以上四个是我们实验室最为常用的。
在做Western Blot实验时，内参即是内部参照。内参基因在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正样本上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。

继续前进

在 Western Blot 实验中，内参是指用于标准化蛋白质表达水平的参照蛋白。内参通常是一种在细胞中普遍表达且表达水平相对稳定的蛋白质，其表达水平不受实验条件或处理的影响。我们跑Western blot除了想知道目的蛋白在细胞/组织中是否表达，更重要的是想知道表达量的高低。Western blot条带的灰度值能够帮我们判断目的蛋白的表达丰度，但前提是你最初的上样量是一样的，这个上样量指的可不是上样体积，而是你的蛋白浓度。所以我们需要内参来帮我们调整上样量，也就是用内参的信号来对目标蛋白的信号进行标准化。

常用的内参有哪些？






以下是一些选择内参蛋白的考虑因素：

表达水平：内参蛋白应该在实验样本中普遍表达，且表达水平应该相对稳定，不受实验条件或处理的影响。通常选择表达量较高的内参蛋白，以便在 Western Blot 中检测到明显的条带， 检测多组织多细胞样本对比表达量时，最好选用 GAPDH作为内参，因为GAPDH是代谢类蛋白，在活组织中表达比较恒定，而β-Actin和β-Tubulin是结构蛋白，不同组织的细胞结构会有差异性。

分子量：内参蛋白的分子量应该与目的蛋白的分子量有明显差异，以便在 Western Blot 中能够区分目的蛋白和内参蛋白的条带。通常选择分子量较大或较小的内参蛋白，以避免与目的蛋白的分子量重叠，一般我们选择内参与要检测的蛋白分子量最好相差5kDa以上。

物种来源：内参蛋白应该与实验样本的物种来源相同，以避免种属间的差异。如果实验样本来自不同的物种，可以选择在多个物种中表达相对稳定的内参蛋白。

细胞类型和组织类型：内参蛋白的表达水平可能因细胞类型和组织类型而异。因此，在选择内参蛋白时，应该考虑实验样本的细胞类型和组织类型，选择在相应细胞类型和组织类型中表达相对稳定的内参蛋白。

实验条件：某些实验条件可能会影响内参蛋白的表达水平。例如，用缺氧、诱导糖尿病等处理时，由于GAPDH的表达增高，不能用来做内参。因此，在选择内参蛋白时，应该考虑实验条件对其表达水平的影响。

长长的路

做过WB实验的同学都知道，除了目的蛋白之外，我们同时还需展示另一个重要蛋白的数据，那便是——内参。


内参，即内部参照（Internal Control）。它是我们WB实验过程中很重要的一个参考系。通过内参结果，我们可以判断：1）实验流程和操作是否正常；2）实验中各组样本上样量是否一致；3）目标蛋白的表达水平是否存在差异。因此内参还被称为上样参照（Loading Control）。
一、 内参选择原则

内参的种类很多，其中包含全细胞或胞浆内参、膜内参、核蛋白内参等，比如β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B等，下面简单介绍下选择内参应遵循的原则：
1. 样本种属来源：

首先考虑实验样本来源于何物种。a、哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3等。b、其他稀少物种来源，可以参照文献指导或是选择高度保守管家基因表达的蛋白作为内参。
2. 目的蛋白分子量：

选择内参时，应该考虑目的蛋白分子量的大小，通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5kDa以上，但勿差距太大。比如目的蛋白分子量为45kDa，此时不适宜选择β-actin 作为内参，可以考虑选择GAPDH或者β-tubulin作为内参。
3. 目的蛋白表达部位：

针对一般蛋白质检测，GAPDH、β-actin 或β-tubulin可以满足要求，而如果需要检测亚细胞器蛋白时，适宜选择对应亚细胞器内参更能体现内部参照的准确性。比如常用的核内参抗体有Lamin A、Lamin B、TBP、YY1、Histone H3。而对于膜蛋白检测，常用的内参抗体为ATP1A1。对于线粒体蛋白的检测，常用VDAC1和COX IV作为内参抗体。
以上原则仅针对通常情况，需要特别注意的是内参的选择还须考虑实际实验环境状况，比如某些细胞或组织由于缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达量增高，此种状况下GAPDH不适合做内参；在涉及细胞增殖相关实验中，c-Jun由于自身表达变化就不适合做内参；在凋亡实验中，TBP、Lamin等不适合作为核内参。因此在设计实验方案时应考虑这些因素的影响并查询相关文献，如果在实验过程中出现内参表达出现异常状况应及时分析原因并调整内参选择。
二、 常用内参展示

常用的内参种类很多，其中GAPDH、Actin和Tubulin是最常用的三个，他们就是上面提到的“管家蛋白”，在几乎所有的哺乳动物细胞中均有高表达，是最常用的胞浆或全细胞内参：
1. GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶），分子量约为36kDa。


2. β-Actin（β-肌动蛋白），分子量约为42kDa。


3. α-Tubulin（α-微管蛋白），分子量约为50-55kDa。


在进行亚细胞器蛋白检测时，适宜选择对应亚细胞器内参更能体现内部参照的准确性。常用的有：
4. Lamin B1（核纤层蛋白 B1），分子量约为66-72kDa，常用作核膜内参。


5. Histone-H3（组蛋白 H3），分子量约为15-17 kDa，常用作核内参勘误：（货号应为：68345-1-Ig）


6. ATP1A1（钠/钾离子转运ATP酶α1肽），分子量约为97-110 kDa，常用作膜内参。


7. COX4I1（细胞色素C氧化酶亚基Ⅳ亚型1），分子量约为17-20kDa，常用作线粒体内参。


除此之外，在检测全血/血浆/血清样本时，也会用到一些内参蛋白，比如Transferrin和Albumin。
8. Transferrin（转铁蛋白），分子量约为77kDa，可作为全血/血浆/血清内参蛋白。


当然，以上并不是全部，还有很多靶标可以作为各种样本的内参蛋白，篇幅有限，这里就不做更多展示了，文末我们会进行一个表格式的汇总，值得收藏！
三、 Proteintech内参抗体优势

明确了内参蛋白，下一步就是要挑选适合的内参抗体了。
那作为专注免疫学领域20+年抗体应用专家，咱们Proteintech家的内参抗体又有哪些值得你心动的地方呢？
1. 内参种类齐全

Proteintech可提供针对各类样本的全套内参靶标抗体，不管是胞浆/全细胞，或是核、膜、线粒体等亚细胞结构，亦或是全血/血浆/血清样本，Proteintech均可提供配套的内参抗体；并且针对同一个靶标，我们还可提供兔多抗、鼠单抗、重组兔单抗等多种选择，全方位满足实验需求。
2. 超高稀释比

在WB应用中，Proteintech的大部分内参抗体稀释比可以达到1:10000，部分能达到1:100000，其中GAPDH鼠单抗（货号：60004-1-Ig）推荐稀释比更是高达1:50000-1:500000，可谓是骇人听闻！一支50ul的小包装，最高可配置25L抗体工作液！（数学好的同学帮忙算算这支抗体可以用多久~>_<）
3. 超多文献引用

如果说以上的陈述都是小P单方面的陈述，接下来的这个数据绝对客观、可靠、且令人震撼！
据第三方平台CiteAb数据统计，GAPDH鼠单抗（货号：60004-1-Ig）目前已被全球科学家引用8138次！也是目前全球被引用最多的一支GAPDH抗体。


除此之外，GAPDH兔多抗（货号：10494-1-AP）被引4875次；β-Actin鼠单抗（货号66009-1-Ig）被引4494次；β-Actin兔多抗（货号：20536-1-AP）被引2582次；α-Tubulin兔多抗（货号：11224-1-AP）被引1070次；α-Tubulin鼠单抗（货号：66031-1-Ig）被引726次；β-Tubulin兔多抗（货号：10094-1-AP）被引644次；Lamin B1兔多抗（货号：12987-1-AP）被引837次；PCNA兔多抗（货号：10205-2-AP）被引713次；Histone-H3兔多抗（货号：17168-1-AP）被引683次......
数万科学家的选择，数万项目的真实案例验证，充分佐证了Proteintech抗体的优质可靠。
4. 看到这里，还没有对Proteintech的内参抗体心动吗？如果您还有什么顾虑，或者还想了解更多信息，可直接登陆Proteintech中文官网查询。
最后，附上小P精心整理的内参抗体推荐列表，大家可以根据上述的内参抗体选择原则，挑选最适合自己实验条件的内参抗体。（温馨提示：表格中部分产品SCI引用数量偏少，主要原因在于产品上线时间晚。其产品质量与高引抗体一致，二者均在同样严格的质检标准中生产上线。）


所以回到标题中的问题：内参抗体怎么选？
小P的答案是：选Proteintech就对啦！
最后的最后，祝愿所有Proteintech的伙伴们，都能实验顺利，早日发文！
笔芯~♥