CRISPR-Cas9靶向敲入insertion /knock in

乔帮主

如何实现CRISPR-Cas9靶向敲入insertion /knock in
敲入
有三种方法
先来说一下第一种方法
就是靶向敲除后再敲入
这种方法呢就是麻烦一些，需要两次的靶向，引入抗性，再把抗性基因替换。
缺点：操作步骤较多，花费时间稍久
优点：不会在基因组上留下抗性记忆等其他非必须的片段



Insertion of a nonselectable DNA fragment by recombineering

再来看看第二种方法


第二种，先引入抗性基因，然后再把抗性基因通过LoxP或者FRR site 消除，但是最终会有一端留下LoxP系统
第三种方法：
采用CRISPR Cas9系统


咱们走（a）（c）这条路试试看看
找到一个特定的可破坏的位点，设计同源臂，便可以实现靶向敲入
下图是在大肠杆菌BW25113菌株中插入T7RNAP片段。



Schematic illustration of DSB induction and homologous recombination.

EXO-Beta-Gam 这三个基因是干什么的呢
λ-Red 重组技术源于 λ-噬菌体 Red 基因座表达的 Exo、Beta、Gam 三个功能蛋白，其能介导基因组序列与外源供体 DNA 发生同源重组。Exo 是一种双功能蛋白，其主要功能是作为核酸外切酶自 5′端降解 DNA，其次是作为重组酶直接促使基因重组；Beta 蛋白功能是作为单链结合蛋白保护来 3′突出端，介导已经完成互补链的退火；Gam 蛋白功能主要是作为阻遏蛋白来防止外源 DNA 被内源性核酸酶降解。
设计思路如下



设计Cas9和sgRNA的质粒

那怎么设计donor DNA 呢


参考文献：
(1) CRISPR/Cas9 mediated T7 RNA polymerase gene knock-in in E. coli BW25113 makes T7 expression system work efficiently
(2) Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/651832567