多色荧光如果两个一抗同种属来源怎么办？

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在免疫荧光实验中，我们常常会在一张切片上共染2-3个指标，有的时候因为靶标的抗体不好找，或者想用已有的抗体进行实验，可能会遇到两个一抗同种属来源的情况。此时如果我们还是按照常规的步骤进行实验，因为两个一抗是同种属来源，那么两个二抗的反应种属也相同，必然会产生严重的染色交叉污染的情况。不过这种情况还是可以通过特殊的处理来避免，如果一定要使用两个同种属的一抗做双标免疫荧光，可以按照以下的3种方法进行实验。
方法一：使用荧光Fab片段进行标记和封闭
1、使用正常的血清封闭之后，孵育第一个一抗。这里的血清建议和两个二抗同种属来源。



2、孵育过量的带荧光标记的Fab片段。这里过量的Fab片段可以完全封闭一抗的可结合位点，并且因为Fab仅带有1个结合位点，所以也不会和第二个一抗有结合，避免了交叉污染。



3、孵育第二个一抗。



4、孵育第二个带有荧光标记的二抗。这个二抗需要和Fab片段同种属来源。


方法二：使用无标记Fab片段替换一抗种属
1、使用正常的血清封闭之后，孵育第一个一抗。这里的血清建议和两个二抗同种属来源。




2、孵育过量的Fab片段。此Fab片段和一抗来源于不同的种属，目的是替换一抗的种属来源。




3、孵育带有荧光标记的二抗，此二抗的反应种属和Fab片段的种属来源相同。



4、孵育第二个一抗。



5、孵育第二个荧光标记二抗，这个二抗需要和前一个二抗同种属来源。



方法三：血清和Fab片段做连续封闭
1、使用正常的血清封闭之后，孵育第一个一抗。这里的血清建议和两个二抗同种属来源。



2、孵育带有荧光标记的二抗。



3、用血清进行封闭。这里的血清需要和一抗种属来源相同。目的主要是为了完全封闭二抗上的所有位点，使其不会和第二个一抗结合。



4、孵育过量的Fab片段。这里Fab片段的反应种属和一抗种属来源相同。目的是为了封闭上一步的血清IgG的所有位点从而使其不会和第二个二抗结合。



5、孵育第二个一抗。



6、孵育带有荧光标记的二抗，这个二抗需要和前一个二抗同种属来源。



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