Western Blotting技术之样品制备

幸福侠侣

Western Blotting步骤中的一个经常被忽视的方面是有效的样品制备，有效的蛋白质提取和纯化步骤对蛋白质印迹实验的结果和解释有重要影响。


Western Blotting步骤中的一个经常被忽视的方面是有效的样品制备，有效的蛋白质提取和纯化步骤对蛋白质印迹实验的结果和解释有重要影响。蛋白电泳的样品制备包括从细胞基质中提取和溶解蛋白样品，去除污染物以及将总蛋白质浓度调节至合适的上样范围。

细胞裂解和分级分离
为进行有效地细胞裂解，产生可溶形式的目标蛋白，需要考虑以下几个因素：
首先，细胞裂解方法，因为不同的样品类型需要不同的方法才能有效裂解细胞；其次，目标蛋白的亚细胞位置，选择一种能富集该细胞结构的方法；最后，合适的裂解液以释放出足量目标蛋白，缓冲液中的除垢剂会影响某些蛋白的裂解效率和溶解性。

常规细胞裂解方法
Detergent Disruption
使用除垢剂
除垢剂剂可以溶解易破裂的细胞，如血细胞或组织培养细胞。NP-40等非离子型除垢剂温和且不变性，但溶解疏水蛋白能力较低。两性离子除垢剂（如CHAPS）和离子除垢剂（如SDS）可有效增加蛋白溶解性，并使蛋白变性。




Mechanical Methods
机械方法
使用匀浆器、超声波仪或组织研磨使细胞受力破碎。超声处理等方法会产生热量，而使样品过热，需使用冷却方法以避免样品过热。在超声处理期间，浸入冰浴就足够了。使用研钵和研杵研磨样品时，需添加液氮保持样品低温。通常会同时使用化学破碎法和机械法来最大限度释放样品中的蛋白质。




Enzymatic Treatments
酶处理
使用可消化植物或细菌细胞壁的酶对细胞进行裂解处理。例如，纤维素酶和果胶酶（植物细胞）、裂解酶（酵母细胞），溶菌酶（细菌）。酶处理之后通常会再使用另一种破碎方法继续处理，如超声。




注意：
无论采用何种细胞破碎方法，均应除去所有不溶物，以免堵塞凝胶孔洞。上样前离心 (15°C 下 20,000 x g，持续 15 分钟)。

细胞裂解量建议




细胞分级
当目标蛋白含量低，或仅存于特定细胞器中，蛋白免疫印迹实验会变得相对困难。在这种情况下，可以采用亚细胞器分级分离来实现最佳检测效果。亚细胞器分级分离可以通过差速离心来完成，也可以通过使用特定的裂解除垢剂来实现。
例如，通过将细胞与非离子型除垢剂（Triton-X或Tween 20） 一起孵育，可以将疏水性（膜结合）蛋白与亲水性蛋白（胞质）分离，从而形成两个不同的层，疏水层和亲水层。也可以使用下述可选的除垢剂靶向不同的亚细胞成分。




                                       Cell Fractionation
裂解液推荐
细胞器位置
裂解液推荐
总细胞裂解
NP-40
核
RIPA或核分级分离，以提高目标蛋白浓度
线粒体
RIPA或线粒体分级分离，以提高目标蛋白浓度
细胞质
Tris-HCl
膜结合蛋白
RIPA（SDS是强力除垢剂，通常适合难以溶解的蛋白质）

通常情况下可使用离心法分离匀浆后的线粒体，细胞核和内质网。如果需要富集特定细胞器，则可以使用细胞分级试剂盒，特别是要检测低表达蛋白时。细胞分级分离过程首先是通过匀浆裂解细胞，开始以较低的速度离心，然后逐渐过渡到较高的离心速度。此过程需要知道目标蛋白的表达位置，并使用正确的蛋白酶和磷酸酶抑制剂。

蛋白质溶解和稳定
为保证电泳成功，必须破坏蛋白质之间的聚集作用。理想情况下，细胞裂解和蛋白的溶解都在电泳样品缓冲液中进行。如果无法做到这一点，则必须在增溶溶液中制备蛋白，该溶液应含有除垢剂、变性剂/还原剂，以及兼容电泳的缓冲液。

裂解缓冲液包含不同的除垢剂，可帮助破坏细胞并释放蛋白，从而使它们溶于溶液。但是，每种蛋白质都是不同的，它们与缓冲液和除垢剂的反应可能不一样。如果目标蛋白没有在溶液中溶解，或者蛋白-蛋白相互作用比较特殊，则需要尝试使用其他特殊缓冲液，并交换去除除垢剂。

全细胞裂解物和膜结合蛋白 — 最常用的缓冲液是 RIPA 和 NP-40。RIPA 缓冲液的强力特性适合难溶蛋白。

核/线粒体蛋白 — 首选RIPA。但是，通常首先使用分级分离方案来增加特定细胞器及目标蛋白的浓度。

细胞质蛋白 — Tris-HCl 有时比 RIPA 缓冲液更有优势。需要实验测试确定最佳条件，以获取更多的目标蛋白。

天然状态蛋白质 — CHAPS 是两性离子除垢剂，特别适合保护蛋白的天然状态。常用于等电聚焦 （IEF） 和 2-D 电泳。

核/线粒体蛋白 — 首选 RIPA。然而，分级方案通常首先用于增加目标蛋白所在细胞器的浓度。

裂解缓冲液配方
NP-40
150 mM NaCl
1% NP-40 or Triton X-100
50 mM Tris pH 8.0

RIPA
150 mM NaCl
1% NP-40 or Triton X-100
0.5% sodium deoxycholate
0.1% SDS
50 mM Tris, pH 8.0

Tris-HCl
20 mM Tris-HCl, pH 7.5

CHAPS
150 mM KCl
50 mM HEPES (pH 7.4)
0.1% CHAPS

还原剂
许多蛋白质通过二硫键形成多聚体，加入还原剂会破坏这些二硫键，从而使样品中的蛋白质以单体形式存在，以下是一些常见的还原剂及其典型用途。

还原剂特点及应用




蛋白质稳定化
细胞裂解后，由于细胞内酶活性的存在，蛋白质会开始发生水解、去磷酸化及变性。在冰上或4°C下制备样品，加入蛋白酶/磷酸酶抑制剂等方法可将酶活性降至最低，裂解缓冲液应在使用前新鲜制备。

可使用市场上的即用型混合抑制剂（专有配方），也可以根据个人需要自制混合缓冲液。下表列出了常见的蛋白酶/磷酸酶抑制剂，它们的靶标以及建议的在裂解缓冲液中的终浓度。

常用蛋白酶抑制剂



常用磷酸酶抑制剂




蛋白样品定量
在电泳上样前，需要知道每个样品中总蛋白浓度，以确保适当的蛋白上样量，避免凝胶过载。此外，还需要保证每个泳道上样量接近，以确保在相同的基础上比较不同样品的目标蛋白表达水平。

测量蛋白浓度的最常用方法是检测280 nm或205 nm处的吸光度。另外还有几种其他测定方法，如Bradford，依赖于肽键的金属离子还原反应；如Lowry和BCA测定法，通过染料结合或还原反应。以上几种定量方法都基于类似的理论基础，即产生与样品中蛋白质量成正比的颜色变化。通过将目标样品与已知标准系列（通常为裂解液中稀释的牛血清白蛋白）进行比较来确定蛋白浓度。为了获得准确的蛋白浓度测量值，最好测试一些样品稀释液，以确保结果在测定的线性范围内。

上样缓冲液
确定蛋白浓度后，将样品在凝胶上样缓冲液（通常为 Laemmli 缓冲液）中稀释。该缓冲液含有甘油，从而使溶液比凝胶电泳缓冲液黏稠，样品容易沉入凝胶上样孔中。上样缓冲液还包含跟踪染料（溴酚蓝），该染料也会在凝胶中迁移，指示电泳迁移距离，显示电泳进展情况。

将样品在上样/样品缓冲液中100°C加热5分钟，或70°C加热10分钟以帮助蛋白变性。变性后的蛋白样品可放置在室温，以备电泳上样；如样品不需要立即电泳上样，也可置于4°C 或 –20°C 长时间保存。

样品缓冲液条件



样品缓冲液配置技巧
防止降解
离心混合物后，需要添加裂解缓冲液和混合蛋白酶抑制剂。可能需要使用不同浓度的混合蛋白酶抑制剂重复此过程，以获得足够高的蛋白浓度。

定量样品
定量样品中的总蛋白含量可确保样品的均等电泳上样。当需要量化不同泳道目标蛋白时（例如在比较对照和实验处理的细胞之间时），这一点尤其重要。相等的上样量使分析时的归一化因子变化更小。

电泳前去除不溶物
细胞破裂后，在 15°C 以 20,000 x g的速度离心 15 分钟以除去所有不溶物。固体颗粒可能会堵塞凝胶孔洞。

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