PCR扩增不出来目的基因，扩了有一个月了，是什么原因？

笑看风云

样品也没问题，引物也没有问题，就是扩增不出来条带

原文地址：https://www.zhihu.com/question/471928383

队长是我

不管是克隆，鉴定还是验证，前期花大量时间设计引物、提RNA，反转录、配胶，忙活几天发现PCR电泳没条带？

搜寻解决办法，利用说明书、百度、知乎、微信，最后答案都只是一些理论方法，不知道怎么做？

开局王炸：
首先，如果你已经设计了引物，PCR扩增没有条带，请这样做：

使用第一次的PCR产物作为模板（1-2ul即可），再进行一次PCR。
什么？！还不行.....

那你要重新学习PCR扩增了！这篇内容，涵盖了实验中可能遇到的PCR扩增问题和详细的解决办法，主要是如何培养遇到问题解决问题的思考能力，你必须要知道！
PCR扩增主要包括以下几个组分：1）引物；2）酶；3）dNTP；4）Buffer；5）cDNA或DNA。注：现今大部分PCR酶试剂盒一般都是酶，dNTP和Buffer的预混液。
因此，需要从引物，酶，cDNA和DNA模板下手，进行分析。
<hr/>第一步，一定要确定的是—cDNA。
每个基因在不同组织，不同时期中表达量是不同的。首先要确定你的基因在哪个组织，哪个时期表达最高，确认之后就选这些组织和时期，否则很难做出来。
问题：怎么查找目的基因在哪个组织和时期中表达高？
答：1）数据库。例如NCBI数据库。




      2）文章。查询你目的基因的别人做过的文章，看看他们使用的什么。




      3）新的基因，没有数据库记载，没有报道，什么都不知道。使用几种组织的混合的cDNA。
<hr/>第二步：最简单的步骤—检查你的酶

酶的品质（主要是公司的工艺好不好），活性，保质期，buffer的冻融程度都会很大程度影响PCR扩增。因此，换一个酶是相对简单，必须试用的方法。
<hr/>
第三步：最需要实验经验—引物设计
解决了酶和cDNA的问题之后，需要进行最复杂的引物设计。引物设计是灵活的，根据目的的不同而不同。qPCR引物设计因为可以在序列上随机选择，因此可以使用引物设计引物进行设计，在这里我们主要详解基因克隆的引物设计，一般包括CDS的设计，基因区的设计，非编码区的设计等，这些片段的引物设计一般都固定在一段序列上，不能随意更改（GC含量，TM值都只能固定在一个相对范围内），因此需要一定的实验经验和理论基础，以下为详细的解决办法。
1. GC含量低于40%或高于60%，长度不在18-25范围内，会出现引物二聚体，设计的引物不能遵循引物设计的原则怎么办？
答：不是所有的引物都必须完全遵循引物设计的原则，也不是所有遵循引物设计原则的都可以扩增出来。例如：GC含量为65%，长度为28，如果实在设计不了完全符合原则的，可以以相对符合的设计方式进行，不必完全符合。
2. 设计了好几组引物，都不能扩增出来，怎么办？
酶和cDNA都确定好之后，引物仍然扩不出来条带，对于不同的目的可以使用不同的方法。
①对于鉴定目的基因，只是想要确定这个基因的序列，可以这样做：
在引物两端加一段碱基（3'端的序列可以自己设计），改变引物的GC含量，TM值等。如图：




②对于仅需要扩增目的基因，不能在3’端添加碱基的情况，且使用F2/R2不能扩增出条带，可以这样做：
先在CDS两端设计一对引物，先使用F1/R1进行扩增。然后再使用CDS引物F2/R2进行扩增。如图：




③对于表达载体，需要扩增到载体上，可以这样做：

1）先设计CDS区的引物F2/R2扩增，再使用这个PCR产物作为模板，使用带酶切位点（蓝色为酶切位点及保护碱基序列）的引物F1/R1进行扩增。如图：




2）改变所用的酶切位点。
2）换连接方法。如果使用T4连接，可以换成同源重组的方法，反之亦可。

PCR扩增需要具体原因具体分析，如有需要，可关注微信公众号”philogy分子细胞实验技术“进行免费咨询，预祝各位逢P就有，实验顺利！

大力水手

一天能做好几轮的PCR，你能连续失败一个月？
“样品没问题，引物也没问题”，是人有问题！
实验做不出来，就换东西，模板、引物、酶kit……无非就是这几个东西，别死磕自己的技术和操作。

大力水手

建议还是先从，样品，引物方面排查一下。您具体提到的样品没问题，引物没问题，是通过什么手段进行排查的呢？比如是DNA样品，完整度是否正常，量是否足够？RNA样品的话是否有降解，以及您关注的靶标是否丰度足够？引物方面，是否设计合理？有没有从不同样品里面测试过？上下游的引物Tm值是否相差太大？其次可以考虑排查的地方包括PCR体系的构建，例如您的模版是否放入水平过多或者过少？引物加入量是否合理？如果是高GC%的模版是否有加入一些辅助剂，辅助结合？另外扩增的温度梯度也可以关注一下，包括了您的退火温度设置，有没有尝试过梯度退火？还有您的后续检测方法，除了凝胶，您有没有尝试过qPCR检测？

检验医师

1。样本是该目的基因的主要表达细胞或组织吗？
2。模板浓度？
3.PCR参数设计：如果片段大，延伸时间可以延长；如果模板混杂，退火温度要在Tm+_1~2°，我最近也是卡死在这个地方，我用的擎科酶，现在扩出来还是很明显的
4。手法问题，多操作几次

感恩由您

有几个方面需要考虑：1.引物设计是否合理？是否有其他人成功过？2.模板质量与拷贝数问题，如果是基因组模板，拷贝数很低，需要适当提高用量，提取的完整性也要检测，尽量用新鲜样品；3.提高合成引物纯度级别，在靠谱儿的公司合成，质量更有保障，不要把合成引物这些花小钱办大事的重要环节上特意省钱，因小失大；4.引物多次使用，注意防止降解，多次失败后，可换一管新引物尝试；5.比例难以令人接受的，检讨一下自己做PCR的水平，比如退火温度设定，酶的选择，品牌选择等