【技巧】Elisa常见样本处理

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Elisa是一种快速、灵敏、准确可靠的定量分析方法。样本的处理对于 Elisa 实验的成功
有举足轻重的作用。
利用 ELISA 进行检测的样本类型包括：血液（血清、血浆），组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清，皮肤组织、尿液、粪便、肺泡灌洗液、唾液、脑脊液、胸腹水、前列腺液、精液、阴道分泌物等。
下面我们就常见的样本处理方法：
  血液样本
血液采取后应尽快进行处理，使血清（浆）从与血细胞接触的全血中分离出来。
Q: 血清与血浆的区别?
A: 血清是血液凝固后缺少纤维蛋原的血浆，故血浆中除尚含有纤维蛋白原和 抗凝剂外，其他成份均等同于血清。
Q: 选择血清还是血浆样本？
A: 由于血清中缺乏很多的凝血因子，但有凝血产物。如果测凝血因子建议选择血浆样本；同时血浆中有纤维蛋白原，如果纤维蛋白原对待检测指标有影响，建议选择血清样本。
大多数情况下二者均可以选择。
处理方法：
血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置 2 小时或 4 度过夜，然后1000×g 离心20分钟，取上清即可。这是一个让血液自然凝固的过程，温度越低，凝集越缓慢，可根据需要添加促凝剂。
血浆：血浆样本需要抗凝，一般建议用2.0%EDTA，1%肝素，3.8%枸橼酸钠作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2~8度1000g离心15分钟，取上清即可检测。根据待检测目标物的性质不同选取不同的抗凝剂。

• 枸橼酸钠(柠檬酸钠)：Ca2+有凝血作用，枸橼酸钠能与血液中的钙离子形成可溶性的螯合物，从而阻止血液凝固。配成 109mmol/L的浓度和血液1:9, 106mmol/L的浓度和血液1:4
  

缺点：血液中溶解度低，抗凝作用较弱。
优点：对凝血因子有很好的保护作用，大部分凝血试验都可用枸橼酸钠抗凝。

• 二胺四乙酸（EDTA）盐：与血液中的钙离子结合形成配位化合物， 从而阻止血液凝固。15g/L EDTA和血液 1:10
  

优点：对红细胞和白细胞形态影响小。
缺点：影响血小板的聚集。不适用于凝血实验和血小板功能相关实验的检 测。

• 肝素：通过与抗凝血酶Ⅲ结合，增强抗凝血酶的作用，灭活丝氨酸蛋白 酶，从而可阻止凝血酶的形成和阻止血小板聚集，阻止血液凝固。肝素钠 1g/L 与血液 1:10
  

优点：抗凝能力强、不影响血细胞体积、不易溶血、能耐高温。
缺点：引起白细胞聚集。肝素抗凝血应于短时间内使用，否则放置过久血 液又可凝固。
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                                    （组织样本一般是制成组织匀浆）
处理方法：
1）取适量组织块，于预冷 PBS（0.02mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液， 称重后备用（组织块较大需先剪碎后再匀浆）；
2）可同时选用多种匀浆方法达到较好的破碎效果：首先将组织块移入玻璃 匀浆器，加入 5-10ml 预冷 PBS(组织与 PBS 的质量体积比建议为 1:5，即 1g 样 本加入 5ml PBS)进行充分研磨（有条件实验室可选用机器匀浆），该过程需在冰 上进行；得到的匀浆液可再利用超声破碎或反复冻融进一步处理（超声破碎过 程中注意冰浴降温；反复冻融法可重复 2 次）。
3）将制备好的匀浆液于 5000×g 离心 5 分钟，留取上清即可检测。
4）如果样本需要长期保存，请添加蛋白酶抑制剂。根据实验需要，组织匀 浆样本可先定量总蛋白,以便于统计分析数据。某些组织样本如肝脏，肾脏，脑 组织会有假阳性反应。
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根据目的物所在部位，可选择细胞裂解液或细胞培养上清作为样本。需要注意的是：
因该类样本干扰因素较多，所以可能存在检测不出的情况。
如果目的物是分泌型，主要在胞外，即可选择细胞培养上清作为样本；
如果目的物主要存在于胞内，则建议选择细胞裂解液作为样本类型。
处理方法：
细胞培养上清：处理方法相对简单，取细胞培养上清，1000×g 离心 20 分 钟，取上清即可检测。
细胞裂解液：
1）贴壁细胞需要先用胰酶消化，离心收集细胞（悬浮细胞可直接离心收 集）
2）将收集到的细胞用冷 PBS 洗 3 次
3）物理方法裂解细胞（可先超声破碎细胞，再反复冻融）：
   i 超声破碎：取适量 PBS 重悬细胞，用一定功率的超声波处理细胞 悬液，使细胞急剧震荡破裂；
   ii 反复冻融：将待破碎的细胞在-20 度以下冰冻，室温融解，反复 3 次，使细胞溶胀破碎；
4）将标本于 2-8 度 1500×g 离心 10 分钟，收集上清备用。
一般情况下，物理方法如反复冻融，匀浆等方法会比化学方法好，因为化 学方法会引入酸或碱，可能会对 elisa 实验产生影响。我们也做了相关实验来评 测化学提取液和洗涤剂对 ELISA 检测的影响，如 RIPA、TritonX-100、NP-40 和 SDS、脱氧胆酸钠、β巯基乙醇、DTT。
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1）选择痰液中较为粘稠部分称重，加两倍于痰量的 0.1% DTT(二硫苏糖醇)， DTT 的主要作用是溶解粘液，用吸管反复吹打，漩涡器振荡 15s，37 度恒温水浴振荡 5 分钟；
2）加入两倍于痰量的 PBS 缓冲液继续振荡 15-20 分钟，150 目的金属丝网过滤，1500 rpm 离心 10 分钟吸取上清液检测。
                                                          粪便
尽量采集干的粪便，粪便过稀会较难处理且降低检测的准确性。采集的重量应大于50mg，将粪便用PBS洗3次（最终粪便质量：PBS 体积=1:9），用超声粉碎（或捣碎）后于5000×g离心10分钟，取上清检测。
                                                           唾液
将样品收集于离心管后在-70 度冰冻 1 小时。在冰上融化样品后，2000×g 离 心 10 分钟，取上清检测。
                                                           精浆
将精液收集于无菌容器中，正常精液射出体外呈稠厚的胶冻状，射出体外后需在室温或 37 度水浴箱中使其在前列腺分泌的纤维蛋白溶解酶的作用下液化变的稀薄。待精液完全液化后，将精液 4000 rpm 离心 10 分钟分离精浆进行检测。
                                                         皮肤组织
用匀浆机加冰的 PBS 研磨 20-50 mg 的皮肤组织使其充分溶解，离心 20 分 钟，10000 g/分钟，取上清检测。
                                                            牛乳
于4度，12000g／分钟离心30分钟，去除上层脂肪，以及下层沉淀，取中间层样本用于检测。
                                                    脑脊液、肺泡灌洗液
样本收集后于1000×g 离心20分钟，离心后收集上清，并将标本保存于-20度，且应避免反复冻融。
<hr/>处理样本的过程就是收集目标蛋白的过程，由于蛋白容易变性，降解，故 该过程应尽量温和。样本处理之后的储存也非常重要，尤其注意不要反复冻融， 样本处理之后可分装密封保存，4 度保存应小于1周，-20 度不应超过1个月，-80 度不应超过2个月。
在标本使用前应缓慢均衡至室温，不应加热使之融解。样本的处理是实验成功的第一步，以上就是关于Elisa特殊样本处。
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