ARMS-PCR技术

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ARMS-PCR
扩增阻滞突变系统PCR （Amplification Refractory Mutation System PCR，ARMS-PCR），又称为等位基因特异性PCR（Allele-Specific PCR，AS-PCR）是Newton等首先建立用来检测已知突变的方法。


ARMS基本原理
如果引物的3′端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计2条引物，其3′端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。此法已用于多种疾病的点突变的检测。
我们都清楚ARMS的简单原理，即理论上Taq DNA聚合酶必须在引物3’末端碱基与模板完全互补情况下才能进行有效的聚合反应，但由于Taq DNA严谨性受多因素影响，某些情况下，即使引物的3’末端碱基与模板不互补，延伸仍然可以进行（如果3′末端只有一个碱基的错配，那么是引物是可以错配结合的并可以进行延伸的，只是延伸的效率低于那些3′末端正好配对的引物），而且不同的3’末端错位（mismatch）有不同的延伸效率（如果在3′末端引入了其他的错配碱基，那么错配的数目太多或达到一定程度，那么3′末端无法进行延伸），因而仅靠引物3’末端一个碱基的错配不能充分而可靠地区分两个等位基因，进而造成假阳性结果。


如何提高引物延伸的特异性呢？
通过人为地使引物3′末端的第二个碱基发生错配来提高引物延伸的特异性防止发生错配，TaqDNA聚合酶缺少3′→5´外切酶活性,因此对于3′末端错配的引物,以低于正常末端配对引物的速度延伸,当错配碱基的数目达到一定程度或者条件达到一定的严谨程度时, 3′末端碱基则因磷酸二酯键形成困难而不能延伸,反应终止,也就得不到特异长度的扩增条带,从而表明模板DNA没有与引物3′末端相应的突变;如果PCR结果能得到特异长度的扩增条带,表明模板DNA上具有与引物3′末端相应的突变。
但引物3′末端的第二个碱基具体突变成哪个碱基这个选择可是大有学问的：为了提高反应的特异性，在倒数第二个碱基处引入了一个故意的错配。举一个例子让大家更好的了解这个故意的错配应该选择哪个碱基。根据下图，我们首先考虑野生型引物与WP-MT的情况，其中WT和MT的1号位T/G表现出弱不稳定错配（黄色）。然后我们看倒数第二个位置来观察模板序列上的碱基，在这种情况下是G。根据图中所示，在两个AS引物中，只有核苷酸A应该放在3号位末端碱基旁边，以确保更强的不稳定。




优 点
1. 操作简单；时间快速；灵敏度高，可检测低至1%的突变
2. 只有一次开盖过程，有效防止污染
3. 整个操作只需Real-time PCR仪
4. 成本较低
缺 点
1. 通量较低，无法在单次运行中检测到数千个 SNP‎‎最后
2. 不能检测未知突变，而 ARMS-PCR 的局限性包括未检测到缺失/其他主要重复和染色体异常
3. 不适于位点附近GC含量过高或过低的SNP的分型检测。如果 PCR 中没有内部控制，或者 PCR 循环期间温度波动，则存在假阴性结果。
此方法适宜于对通量要求不高的实验室进行突变检测，特别是体细胞突变


作者：海星生物
公众号：Cas9X细胞基因敲除
以上内容由海星生物（http://www.cas9x.com)提供
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