基因编辑具体怎么操作的呢？

千姿百态

最近基因编辑上热门，我知道这个是法律严令禁止的，我也非常反对做这个试验。。只不过我好奇，这个基因编辑到底从头至尾到底怎么操作的？基因在哪里？怎么提取基因？用什么去编辑？编辑了又怎么保存？实在是，一点概念都没有。求科普，用通俗易懂的语言来描述一下基因编辑的知识和操作方法。
原文地址：https://www.zhihu.com/question/303782438

清风寡欲

1. 基因敲除

进行DNA水平编辑。一般用于构建基因敲除鼠模型。
CRISPR/Cas9：CRISPR/Cas9系统作为细菌和古细菌的获得性免疫系统,通过RNA介导特异性的切割外源遗传物质,用以对抗入侵的病毒和质粒。使用Cas9切口酶和一对sgRNA,两个相近的切口造成DNA双链断裂,诱导细胞发生非同源末端连接修复,造成目的基因的突变。
CRISPR/Cas9技术自问世以来，取代“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN），成为科研、医疗等领域的有效工具”.一般通过体外转录得到sgRNA与cas9的mRNA,通过注射到原核期受精卵内，移植到假孕母鼠体内获得基因编辑的小鼠进行基因功能研究。



构建方法：
1. 确定待敲除基因的靶位点。
2. 设计识别靶位点的识别的一对sgRNA。
3. 构建可表达sgRNA的Cas9质粒。
4. 体外转录sgRNA 和Cas9 RNA。
5. 将sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵检测sgRNA活性。
6. 将有活性的sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵建立Founder。
7. 将Founder自交得到F1代。
适用范围：
制备敲除鼠，利用敲除鼠进行基因功能的研究；进行细胞水平敲除基因时，可以选择慢病毒载体，构建lenticrispr-v2质粒，通过包装病毒进行细胞水平敲除。
2. 基因敲减

RNA水平，是指通过降解具有同源序列靶基因的mRNA，达到阻止基因表达的作用。一般用于细胞水平敲减基因。
（1）RNA干扰：
是siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物RISC。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA,该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异性的转录后基因沉默。
一般合成针对靶基因的siRNA,通过转染的方法使之进入细胞内，使靶基因沉默。这一方法受转染效率的影响较大。目前有不少基因的siRNA已经有商业产品，所以使用时买来就可以了，比较方便。



适用范围：
一般通过公司合成后，通过转染细胞进行细胞水平敲减。
（2）shRNA：
“短发夹RNA”，shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。随后再连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。
构建shRNA的病毒表达载体，常用的病毒载体有腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体等，机制与质粒载体相似，利用了病毒感染细胞效率比较高的特点，解决了用质粒载体转染效率低的缺陷。



构建方法：
1. shRNA设计：设计RNA干扰序列是RNAi实验的关键。
2. 载体构建:可根据实验需求选择慢病毒、腺病毒载体。
3. 转染细胞：常用的方法包括磷酸钙转染、脂质体转染、电穿孔转染等
4. 观测GFP 荧光和稳定表达细胞系筛选:可用于带有GFP标签的质粒载体。
5. 检测RNA 干扰效率:可以在蛋白水平或mRNA水平检测RNA干扰效率。
适用范围：
一般通过构建慢病毒、腺病毒等进行细胞水平敲减。
<hr/>更多内容，请在微信搜索公众号“解螺旋”

检验医师

大家对基因编辑技术并不陌生，这是一门特异性靶向改变遗传物质序列的技术。
近年来，基因编辑技术发展迅速，从第一代DNA核酸酶编辑系统ZFNs、第二代TALENs到第三代CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)系统。
2012年zhang feng等人在体外重构了该系统并且在人类细胞中证明了CRISPR/Cas9的基因编辑能力，随着技术不断革新，不仅仅是基因敲除，基因插入的成功率变得越来越高[1]。
基因编辑并没有被法律禁止，只是人体伦理部分的实验被禁止，当然违反人伦这事在任何技术应用上都是不允许的，(我不知道都敲了几十个基因了也没人来抓我啊：）)
基因编辑除了在治疗上起作用，在各大生物化学实验室中也作为作为一种普遍的基因编辑工具得到广泛运用，常用的就是将你感兴趣的片段敲除或者插入你的研究对象：大鼠、小鼠、斑马鱼、线虫、各种植物，各种细胞来进行研究。或者采用商业化的Lentiviral CRISPR gRNA Library文库来进行感兴趣位点的高通量筛选，比如筛个药物靶点之类的。
本文从选定基因，设计序列，到转染，筛选，鉴定到获得成功的单细胞一条龙服务介绍，做完这一套，大概需要两三周之久。（如果遇到挫折也许会更久）
实验步骤参考见文末，[2][3][4]本文实践并经过本实验室各位师兄师姐的心血获得不断改进。可直接用作protocol使用，字数很多！！图也很多！！只是感兴趣的同学看一下实验材料板块即可。
有问题欢迎私信交流。
<hr/>我们需要如下材料：

• 目标细胞，我们的客户。
  
• 带有cas9的载体PX459（用来导入Guide序列,购买链接：http://www.addgene.org/108292/），对于难以转染的细胞通常使用lentiGuide-Puro载体来进行慢病毒包装（购买链接：http://www.addgene.org/52963/），这是我们的剪刀。
  
• Guide序列：根据敲除的基因送公司合成（不是直接提取啦！），一般为20个碱基对，敲除的特异性和高效性已经脱靶效应取决于此，这是我们剪刀长的眼睛。
  
• 转染的药物：polyjet或者lipo2000,PEI等，这是将剪刀送到细胞里面的顺丰快递。
  
• 筛选的药物：嘌呤霉素（puromycin)用来筛选成功转染载体的细胞，这是检查快递送的售后小哥。
  

一句话概括就送个快递的事~送进去之后该系统就会自动启动了，而且基因剪刀会整合到基因组上，意思就是一旦敲除成功那么这个细胞的子孙后代都完蛋了，保存就冻存该细胞就行。
敲除成功的细胞测序结果为两个等位基因都在PAM区前三个位点发生了碱基为非3倍数的缺失或者增加。
我们需要如下软件：

• UCSC: http://genome.ucsc.edu，用于下载目标基因的全序列
  

2.设计guide的网站：来自张锋老师的网站：http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html
3.使用的载体为pX459V2.0-eSpCas9(1.1)，可以在addgen官网直接购买
（http://www.addgene.org/108292/）。
<hr/>详细步骤如下：
1.这是px459的图谱，65美元，你先买一个。
这是一个一体化的设计：将识别切割位点的前导序列gRNA和具有切割功能的序列Cas9连接到一个载体上，使用时只需要将该载体转导到细胞内部即可。



编码剪刀CAS9的区域和用作识别敲除的位点的gRNA链接到了一个载体上，图来自：http://www.addgene.org/108292/

2.接下来介绍如何针对你的需求来设计gRNA并连接到这个载体上。
首先打开guide设计的网页：http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html（感谢zhang feng lab提供的无偿使用权）



网站截图

3. 获得了需要的寡核苷酸片段按照分数从高到低排列，这里给出的核酸序列在第二列包含20个碱基加上NGG，我们需要把这20个核苷酸以及它的方向互补序列送去合成并加到之前提到的PX459序列上。这里的设计已经把特异性高效性和基因可靠性都考虑了。我们只需要复制粘贴即可。



网站截图

4. 为了将这20个核酸插入PX459载体，我们需要借助一个限制性内切酶BBSI把载体切出一个小口子，并包含两个粘性末端。
然后将我们设计的的20个核酸两侧添加上互补的粘性末端。值得注意的是，PAM区也有可能出现在反向序列，这时设计gRNA就要反向添加粘性末端。


5. 经历一系列分子克隆的常规操作：酶切，连接，转化，涂板，挑菌，抽质粒，送测序，测序成功。至此我们已经把所需要的载体都构建完成了，接下来我们将该载体递送到所要敲出的细胞中，常用的方法包括脂质体递送，电转，或者显微注射。比较经济的方法就是转染，利用转染试剂将质粒运进细胞内。6孔板的细胞，大约500ng质粒足够。
6. 运进细胞后，前导序列识别基因组上的PAM区（NGG），并且连接到基因组上，CAS9开始工作并切割。



RNA引导的Cas9核酸酶示意图。DOI:10.1038/nprot.2013.143

7. 转染后48小时，更换含有puromycin（嘌呤霉素）的培养基，筛选转染成功并表达该质粒的细胞，因为载体上带有嘌呤霉素抗性，所以只有转染成功的细胞可存活。筛选浓度根据不同的细胞进行调整。
8. 筛选完毕以后，手动或者流式分选将单个细胞分选到96孔板中，静置2周或者3周等待单克隆细胞长成单群落。然后挑选初筛检查被敲除的蛋白是否表达，进一步挑选单克隆细胞进行测序。如果是进行基因敲减实验，直接用第6步最终筛选的pool细胞做实验也可。单克隆筛选是为了获得突变均一的细胞系。
9. 由于Cas9技术只管切不管修，所以修复过程在不同的细胞是不一样的，测序结果也千差万别，我们认为敲除成功的细胞测序结果为两个等位基因都在PAM区前三个位点发生了碱基为非3倍数的缺失或者增加。
该实验成本很低但是效率很高，这也是该技术能够迅速在各个实验室得到广泛利用的全部理由，只需要送合成sgRNA这里需要花钱，20个碱基也就是几块钱，其余的包括细胞培养，筛选，测序全套下来还是非常经济的。
我自己做的一般96孔板一块板子可以挑选出来60%的单细胞（我们实验室手动分选可能会细胞间污染），最后测序成功被证明为可以继续使用的细胞也在10%以上。

检验医师

你可能不了解遗传，但一定听说过一句成语，叫“种瓜得瓜，种豆得豆”，这个现象背后的原因就是遗传。遗传现象在人的身上也有很多体现，例如，“你的眼睛像妈妈，鼻子像爸爸”，这是因为爸爸妈妈把这些特征遗传给了你。
看到这儿，爱思考的你可能会有疑问了，为什么会有遗传现象呢？难道和爸爸妈妈相处时间久了，就会越长越像吗？别着急，我这就给你解释。
要想知道遗传现象产生的原因，你需要知道两个名词，一个是“DNA”，一个是“基因”。这两个词你一定不陌生，电视剧中常有“DNA亲子鉴定”的剧情，医生用检测DNA的方法来判断孩子是不是亲生的。“基因”这个词你就更熟悉了，漫威超级英雄蜘蛛侠的超能力，就是基因变异的结果。
那DNA和基因到底是什么呢？


△DNA
DNA是决定生物体遗传性状的遗传物质，我再重复一遍，DNA是决定生物体遗传性状的遗传物质。现代遗传学认为，DNA分子上一些特定的片段包含着遗传信息，我们把这些起着遗传作用的DNA片段称为基因。这句话看起来有点绕，不过没关系，你只要知道，一个DNA分子包含成百上千个基因，而基因有遗传作用就行。
既然基因能遗传，那也就意味着如果爸爸妈妈身上存在疾病，就有可能遗传给孩子。就拿哮喘这个病来说吧，如果父母都有哮喘，子女患哮喘的概率大大增加；如果父母都没有哮喘，子女患哮喘的可能性就非常低。
看到这儿，我要带着你开一个大大的脑洞。科学家们可不可以通过技术手段，把那些让人生病的基因删除掉，让它无法遗传给下一代呢？
有科学家想到了这种方法，并且付诸了实践。去年11月，南方科技大学副教授贺建奎宣布一对名为露露和娜娜的婴儿诞生，由于这对双胞胎的一个基因经过修改，所以她们出生后就能天然抵抗艾滋病病毒HIV。


首先，我先来给你解释一下，人为什么会感染艾滋病。
在人类的全部基因里，有两个基因和艾滋病是密切相关的，一个基因叫做CCR5，另外一个基因叫做CXCR4。
这两个基因很“调皮”，他们和艾滋病病毒有“接头暗号”，一旦它们被艾滋病病毒识别，健康的人就会感染艾滋病。科学家们知道了这个原理之后，就想，如果这两个基因没有了，人类不就对艾滋病免疫了吗？基因编辑婴儿露露和娜娜，就是这个试验结果的产物。科学家将她们体内的CCR5基因删除掉了。
但是，科学家们在这个试验中，忽略了一个关键问题。那就是，基因是很复杂的，一个基因掌管着多个功能。换句话说，科学家把一个CCR5基因删除掉，表面上看起来，人体不会感染艾滋病毒了，但是这个基因很可能还控制着视力、触觉等功能，那么这些功能也可能会受到影响。长远来看，后果是无法被人类预测的。
除了这个问题，露露和娜娜的基因删除过程也让人担心。首先，我先跟你解释一下，基因编辑是怎么操作的。科学家给受精卵中注入一种物质，这个物质有两个作用。第一个作用是“导游”，负责指路。第二个作用是“小剪刀”，负责剪掉基因。“导游”带着“小剪刀”找到要剪掉的基因后，进行剪断的操作。但是问题在于，这个导游能不能准确找到基因，“小剪刀”能不能顺利剪掉，还是一个未知数。


露露和娜娜的结局，验证了我们的担心。这两个小女孩的基因编辑称不上成功，因为她们没有达到预期的效果。具体来说就是，娜娜多出两段不明来源的基因片段，而露露的CCR5基因仍然存在，并没有完全删除。
最后，我们来总结一下。今天，我带着你近距离接触了“DNA”和“基因”这两个概念。我们知道了，DNA是决定生物体遗传性状的遗传物质，一个DNA中包含多个基因，这些基因有遗传作用。接着，我给你讲了“基因编辑婴儿”露露和娜娜的故事，你应该大致明白了，人类的基因很复杂，而且，每个基因之间都存在着千丝万缕的关联，稍有不慎就可能导致严重的后果。所以，基因编辑的试验必须非常慎重才行。
好了，今天的故事讲完了。看到这儿，你是不是对生命充满了敬畏感？也收获了一个可以讲给小伙伴的关于基因的故事？
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长长的路

基因在哪里？
基因在细胞里。现在大家都知道人体是由细胞构成的。一个细胞直径大约10-20微米，大概是头发丝粗细程度的四分之一。每个人全身大概有40万亿-60万亿个细胞。每一个细胞里，都有这个人全套的基因。
基因是一个比较抽象的概念。生物的发展是从大到小的。人类在1900年左右确定了“孩子和父母长得像”的现象是有规律的——肯定有一种物质把父母的长相传给了孩子；而且孩子传到父亲还是母亲的特点是有随机的，算出来一家一半。于是人们创造了基因这个概念，用来指携带一个特别性状的神物物质的单位，设想世界上有“红头发基因”“绿眼睛基因”“有耳垂基因”等等很多基因，但是人们一直不知道基因的物质基础是什么。一直到1953年，人类才确定这种神秘的物质本质上是细胞核中的DNA。
DNA就像是英文里的字母。单个字母没有意义，但是好几个串在一起就有了意义。细胞里的有很多条DNA长链，每个长链上有很多很多字母，有些字母不携带形状，有些字母组成基因。所以一条DNA长链差不多就是这样：
...ADMNAKGNDOGDGJEDMGEATJDJGKLGNAPPLEJIGHDJG...
——这条长链里有DOG、EAT、APPLE三个基因。
英文有26个字母。DNA只有4个字母，却表达了大约两万个人体基因。因此，一个基因通常需要几千个DNA字母（碱基对，bp）才能写清楚。



基因和DNA结构示意图



从人体到DNA

怎么提取基因？

的确有办法可以把DNA从细胞里提取出来，然后读出它记录的基因。现在市面上就有很多个人基因检测产品和服务。但是把基因提取出来容易，原位放回去就难了。所以基因编辑的过程不需要提取基因。我们要基因好好待在细胞里，我们把剪刀递进细胞里去，让基因在细胞里原地被编辑。
怎么把剪刀胶水递进细胞里去呢？通常是用特别处理过的病毒。这些特别处理过的病毒没有毒性，可以非常快速地进入细胞，把它们包裹在外壳里运送的货物释放到细胞里。我们把基因编辑用的剪刀包进病毒的外壳里，把病毒溶液滴在细胞培养液里，剪刀就会被递进细胞。



递送基因编辑系统进细胞

用什么去编辑？

现在详细地讲基因编辑用的剪刀。以前面举例用的那段“DNA”来做例子：
...ADMNAKGNDOGDGJEDMGEATJDJGKLGNAPPLEJIGHDJG...
基因编辑的过程不过三个步骤：（1）识别目标基因。如果我要编辑DOG基因，就要先把DOG从一大堆字母里找出来找出来。人体的基因组有大约30亿个碱基对（字母）。（2）定位目标基因。一旦看见了DOG，就要把手伸过去捏住DOG左边一点点，方便落剪子。（3）剪切。把DOG用剪刀剪下来。只剪掉比较容易，剪完以后的两个头有办法自已粘上。如果要把CAT基因粘到DOG的位置也是可以的，但是稍微复杂一点，失败风险也更高一点。



“基因剪辑”

人类从发现DNA分子以来，就一直希望能编辑DNA（也就是编辑基因），也发明了好几代的基因编辑技术。它们都逃不开上面的三个编辑步骤，因此它们的编辑系统也都有两个模块：识别定位模块和剪刀模块。
前几代基因编辑技术都特别复杂难用，主要是因为识别定位模块和剪刀模块都是酶。每尝试编辑一个新的基因，就要从头造一种酶。这相当于每次面对一把新的门锁，都要从头临摹锁孔，设计并铸造钥匙，造出来显然不一定对，不一定能伸进锁孔里。直到2012年，一种叫CRISPR-Cas9系统被发现了。这就是新闻里的实验采用的基因编辑技术。这种技术的识别定位模块不是酶而是RNA。这就相当于，我们手边有所有钥匙上齿的部件，只要锁孔临摹好了，把对应齿拼成钥匙就一定能开锁。CRISPR-Cas9是科学家从古细菌里发现的，它可以编辑人体细胞DNA的这一发现给生物医疗领域带来了颠覆性的技术进步。
如果我们举例用的DOG细胞是“长耳垂细胞”，那这一步编辑也许就能让后代没有耳垂。如果DOG是“红头发基因”，CAT是”黑头发基因“，那剪掉DOG粘上CAT也许就能让本该是红发后代变成黑发。当然这只是比方，耳垂和发色实际上都由很多个基因同时控制。但是的确有一些遗传病疾病，是只修改一个基因就可以治好的（艾滋暂时不在此列）。



CRISPR-Cas9系统原理示意图

编辑了又怎么保存？

把前面的内容串起来，把和目标基因对应的CRISPR-Cas9系统塞进特殊的灭火病毒里，递送到细胞内，就可以编辑目标基因。这样，我们就获得了一个经过基因编辑的单细胞。
细胞是可以养的。把一个细胞放干净、温暖、潮湿、控制二氧化碳浓度的好地方，它过一会儿就会分裂成两个，再过一会儿两个变四个。一般生物医学实验室都养细胞，用于这样的实验没有问题。这是因为，成体细胞再怎么样，也只会养出一片一模一样的细胞；如果养干细胞，可能分化会养出几种细胞；但是，不会养出胚胎。

继续前进

基因编辑意味着能够人为改造遗传物质，特别是对特定片段的敲除、加入等，与基因工程有一些类似之处。当前，最抢眼的基因编辑技术就是CRISPR/Cas9了，CRISPR就是clustered regularly interspaced short palindromic repeats，即成簇规律性间隔重复序列。
CRISPR是由短的（大概20~50碱基对(bp)左右）DNA重复序列形成的断续结构组成的，这部分存在回文（回文指的就是12321,2378732,AGTTCCTTTCCTTGA这样的结构，进化上形成高度回文的序列，可作为一种保护基因免遭遗传漂变和突变轰炸的策略，在人类的Y染色体上就发现了9个大规模（可长达百万pb）回文结构）排布，重复序列之间被25~70碱基对左右的非重复序列隔开。重复的部分和间隔的部分分别称为重复序列(repeats)和间隔序列(spacer)，此外参与CRISPR构成的还有一个具有类似启动子的前导(leader)序列。CRISPR-Cas系统存在于至少40%的细菌和90%的古生菌中，是细菌用以记忆、识别和抵抗噬菌体的系统。而正是它能够修改遗传物质，进而将病毒基因从自己的基因组内踢出的能力引起了注意。Cas就是CRISPR-associated sequence即CRISPR关联序列，它是由好几个与CRISPR相关的基因组成的序列。
不过，CRISPR/Cas9并不是唯一的基因编辑技术。在此之前还出现过锌指核酸酶(zinc-finger nucleases)和转录激活因子样效应核酸酶(transcription activator-like effector nucleases)等，这两种基因编辑技术，题主可自行了解，这里就只介绍CRISPR/Cas(9)系统（技术）了。
CRISPR/Cas系统最初是日本人在研究一种E.coli蛋白的时候发现的，2002年才被Jansen命名。它有I，II，III三种类型，类型I广泛分布，在Cas3（一种核酸酶）的参与下降解外源DNA；类型II只在细菌中发现，由Cas9（也是核酸酶）参与，类型III还分A,B两种亚型，比较复杂，它们则似乎是古生菌特有的。在它们当中，Cas9最容易技术化（因为它单独行动，无需跟其他核酸酶合作），所以就有了CRISPR/Cas9技术（当然，还是经过了改造以后才得来的）。
细菌在识别外源序列（如何识别，细菌当然自有策略）以后，Cas蛋白就会出动。Cas9蛋白质的身上有两个部分(Ruv和HNH)，相当于“剪刀”，被用来切割DNA（当然是先与之结合，把自己固定在目标DNA上，再大刀阔斧地进行切割），这两个部分分别负责一条链（这种快速而简单的切割方式，正是它受到青睐的原因），即便因为这两个部分发生突变失去切割能力（这样的Cas9就叫做dead Cas9简称dCas9），Cas9依然可以在sgRNA介导之下，通过与靶基因结合，阻断它的转录或者干脆使之无法转录。如果觉得不够直观，可以见下图。


其他Cas蛋白复合物会负责割取目标DNA的一些小段，作为间隔序列插入到自己的CRISPR部分，就实现了对外源DNA的记忆，但又不至于受到损害。如果同类噬菌体再度入侵，相应的CRISPR序列迅速转录生成pre-crRNA(即crRNA前体)，Cas复合体与另外一种RNA(tracrRNA)作用剪切这个前体，生成crRNA，(是不是与hnRNA最终被剪切成mRNA有异曲同工之妙？)crRNA与前两者形成复合体，就可以识别和剪切与crRNA互补的位点。（在细胞中，其实一部分机制与此类似的阻碍（调节）蛋白质合成的DISC即RNA诱导沉默复合体，也能帮助免疫系统相对脆弱的昆虫和植物抵抗病毒。）
那么实验人员是怎么改造Cas9的呢？其实介绍了细菌体内CRISPR/Cas9的功能，它的技术改造就很好说了。上面提到crRNA在形成后与tracrRNA与Cas9形成三聚复合体。但是事先，tracrRNA和crRNA会结合成二聚体。然而在细胞里，需要稍作改变。我们必须设计一种sgRNA代替这种二聚体，与Cas9形成另外一种二聚体。这种sgRNA是从宿主细胞的意义上来说的，以为它必须与靶基因匹配，才能使Cas9顺利行使切割功能。然后，还需要一个用来定位的装置，那就是核定位信号。无需准备修复策略，因为细胞本身自有办法。(详细的技术机制，我有时间再写。)
但是由于这是一项新兴技术，所以它还存在诸多缺陷，包括无法避免因种间差异而引发的效率挫伤，脱靶之类，所以还需更多改进。
当然，在这篇回答里我可能讲得还不是很清楚。你可以看一看我写的一篇文章：
杜瑾鸿：核酸的剪刀——CRISPR/Cas
参看文献：
Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., et al. (1987) Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriology,169, 5429-5433.
Jansen, R., Embden, J.D., Gaastra, W., et al. (2002). Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular Microbiology, 43, 1565-1575
Wei, C.X., Liu, J.Y., Yu, Z.S., et al. (2013) TALEN or Cas9-rapid, efficient and specific choices for genome modifica[1]tions. Journal of Genetics and Genomics, 40, 281-289