PCR基本步骤及注意事项

检验之星

整天谈论测序，那测序里面关键的一环是什么呢？当然是PCR了。本次小编就写给只会做分析而不会做实验的的生物信息小伙伴们。很重要奥，所有的分析最终都要落到验证上奥！

一、实验原理
PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法，它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而体外PCR反应同样需要类似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列，实现对特定位置的扩增；PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境；反应过程同生物体内一样，DNA双链打开，引物结合模板，延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链，而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链，在退火温度处引物结合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子，进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。
在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

模板
1.模板可以是多种形式，主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物，cDNA等，但不能为RNA。对于不同类型的模板，其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够，质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。
注意cDNA为单链DNA，但仍可做PCR的模板，只不过在第一轮循环时只有一个引物结合，合成另一条链。从第二轮开始，两个引物均与特异位点结合，从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增，原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶，只能特意识别DNA链。
2.对于模版的量来说，一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂，提取的浓度也往往比较大，为防止浓度过大对PCR造成影响，故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单，且提取浓度一般较低，则无需稀释。

引物
１．一般引物用贮液浓度为10uM。对于刚合成的引物可以根据期管壁上的说明计算稀释至10uM即可（一般引物说明上配制的浓度往往过高，所以必须稀释至10uM才能利用实验室最小刻度（0.5ul）的移液器取到）。另外引物一旦稀释完毕，应注意分装小份，防止在用的过程中反复冻融引物而造成引物的失效。
2.一般25ul反应中引物用量为0.5ul（终浓度要求为为0.1——1uM），若引物若放置时间比较长，则可以适当增加引物的用量。引物用量过多，容易导致引物二聚体（电泳时位于前方不成条带的小片段）的出现。
附：
1.引物稀释的方法：配制时首先将合成的引物12000r/min离心5min，室温静置１分钟，然后再慢慢打开管盖，根据引物合成单（或储存引物的离心管）说明加入一定量的灭菌水（引物说明是加入Buffer，此处加入无菌水即可）以达到10uM的浓度，在漩涡振荡器上充分振荡5-10min，即配成10um的贮存液，-20℃保存备用
2.引物设计软件的使用。附引物设计的原则

PCRbuffer
一般PCR Buffer为10×的，使用时终浓度应为1×。如25ul体系中，应加入10×PCR Buffer为2.5ul。另外使用时应注意是否添加了Mg2+，若没有，则需要再单独添加，有则无需。
Mg2+
推荐用量为１—４ｍM。浓度过低，影响PCR产物的产量，而浓度过高，则出现非特性扩增。在PCR反应中Mg2+浓度，需进行优化。
三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）
避免反复冻融，应分装小份。dNTP的浓度取决于PCR反应体系中的特定靶序列的长度，常用浓度为0.2 mM。 据此我们可以确定反应体系中的dNTP的最低适宜浓度。当dNTP的浓度大于50mmol/L时会抑制Taq酶的活性。需要注意的是dNTP与Mg2+之间的浓度关系。因为dNTP中的磷酸基团可与Mg2+结合，使反应体系中游离Mg2+浓度下降从而影响Taq 酶的活性。
Taq酶
PCR使用的Taq酶在反应时由于丧失3’——>5’外切核酸酶活性，因而不具有校正活性。在典型的一次PCR反应中，taq酶造成的错误的核苷酸错误的掺入率大概为每20000个核苷酸中就有一个，虽然表面上看起来不会有多大的影响，但是在分子克隆中如果有一个错误核苷酸掺入，很有可能造成移码突变，影响是严重的。为弥补taq酶这一缺点常将克隆后的序列进行测序，来确认所扩增序列的准确性。同时也可采用保真度更高的Pfu DNA Polymerase，来确保扩增的准确性，Pfu DNA Polymerase有3 ’-5’的外切酶活性，5’-3’外切酶活性，是目前已发现的所有耐高温DNA 聚合酶中出错率最低的。但PCR产物为平端，不能进行Ta克隆！而解决此问题的办法是使用TaqPlus DNA Polymerase，该酶是Taq 酶和pfu Polymerase的混合物，因此既能保证准确性又能保证能够进行Ta克隆。在使用中应该注意如下问题：

1．25ul体系中一般用量为0.1ul（用枪头沾一下即可），用量过多可能会出现非特异性扩增。
2.PCR体系构建过程中最后加入的一种成分，因此只有在其他试剂加完之后才可从冰箱中取出加入。
3.Taq酶中含有甘油，故不结冰，若结冰则应丢弃。
4.对于预变性时间较长的PCR反应，应在预变性即将结束后加入酶，减少长时间高温对酶活力造成的损伤。
5.保存时间过长的酶可以适当增加用量。

三、体系构建

1.加样原则是酶最后加，倒数第二加的为模板。加样时应从离心管底部将各成分依螺旋式上升的方式加到管壁上。如果做多管PCR，那么按照如下方法计算出公共成分做n管时所需总体积然后混合均匀之后再分装到各个离心管中去，这样可以有效地避免误差及污染。
V总 =V标×（n+1）
其中V总需配制的总体积V标每管PCR反应需要某成分的标准体积，n表示所做PCR的管数。
2设立适当的阳性对照和阴性对照，检测PCR各试剂的可用性及污染性，便于对电泳结果准确的分析。

四、预实验

准备一个冰盒，并将做PCR的各试剂（除酶）、模板及无菌水放到冰上融化，设置PCR仪上反应程序。

五、实验步骤

下列步骤均在冰上操作
1.   取1.5ml离心管，加入各公共成分（除酶）的V总，然后分装于各PCR管中，最后将酶加入。
2.   瞬时离心10s，将各成分混匀。
3.   放入PCR仪反应。
4.   4℃冰箱保存。
5.   电泳检测。
注：常用于PCR的DNA聚合酶多要求反应必须冷启动，即反应必须在瞬间从低温达到变性温度（一般94℃）。但有些酶需要热启动，则无需在冰上操作，但酶同样还是需要现用现取，保持酶的最大活性。
示例 PCR反应体系（25µl）及条件如下：
质粒DNA                                     0.5µl
上游特异性PCR引物                  0.5µl
下游特异性PCR引物                  0.5µl
10×PCR buffer                                   2.5µl
Mg2+                                                  1.5µl
dNTP                                                 0.5µl
Taq PCR聚合酶                         0.1µl
灭菌水                                        18.9µl

预变性      94℃ 2min
变性        94℃ 30s
退火        59℃ 30s
延伸        72℃ 1min
循环数      30 cycles
后延伸        72℃ 10min
后续进行结果分析！

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