DNA的提取方法

幸福侠侣

一、病毒DNA提取方法（以乙肝病毒为例）
1、改良裂解法：把20ul血清加入0.5ml离心管中，再加40ul 0.2M NaOH，在100℃煮沸10min，加入250ul 0.04 M tris HCl pH 7.5于-20℃备用。
2、苯酚-氯仿法：血清100ul加入0.5%SDS和蛋白酶K(终浓度为100ug/ml)70℃消化3h。加等体积的苯酚、氯仿、异戊醇混合物（体积比25:24:1）和氯仿、异戊醇混合物（体积比为24:1），各抽提一次，留水相，加入1/10体积约3mol/l醋酚钠和2-2.5倍体积的预冷无水乙醇，离心沉淀，再用70%的乙醇洗一次，自然干燥，37℃在100ulTE中溶解，4℃冰箱贮备用。
二、细菌DNA提取
1、水煮模板法-主要用于PCR反应:接种单菌落于LB培养基或脑心平板，连续划线，37℃培养18-24小时。刮取1-2接种环菌苔加入150ul三蒸水中，混匀，100℃煮沸10min。12000r/min，离心10分钟，取上清，-20℃保存备用。
操作简单，对试剂条件要求低。缺点是纯度不高，有可能会含有RNA、蛋白质等杂质。
2、CTAB/NaCL法：
    接种一单菌落于5ml LB中，37℃培养过夜；
    取1ml种子培养液接入100ml 2% LB 中，220r/min培养16小时；
    5000r/min离心10min，弃去上清；
    加入10ml TE离心洗涤，用10mlTE溶解菌体，混匀，-20℃保存备用：
    取3.5ml菌悬液，加入184ul 10%SDS，混匀，加入 10mg/ml蛋白酶K，混匀，37℃温育1小时：
    加入740ul 5mol/l NaCl，再加入512ul CTAB/NaCl，混匀，65℃温育10min；
    加入等体积的氯仿、异戊醇，混匀，10000r/min离心5分钟，保留上清；
    上清中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），混匀，10000r/min 离心5min,保留上清；
    加入0.6倍的异戊醇，混匀，10000r/min，离心5分钟，收集DNA沉淀，用70%乙醇离心洗涤DNA沉淀；
    用1ml TE溶解DNA,加入终浓度为20ug/ml RNaseA，4℃保存。
3、盐析法
    1.5 ml 对数期菌液；
    12000rpm 30；
    加200ul裂解液（同CTAB/NaCl法），12000 rpm 10 min；
    上清用粗枪头取脂新管；
    等体积苯酚充分混匀，12000rpm 3min，反复抽提至无蛋白层；
    取水层，等体积氯仿混匀，12000rpm 34min；
    取上清液至新管，2倍体积预冷无水乙醇；
    -20℃,20min,14000rpm,15min；
    4000ul 70% 冷乙醇洗涤；
    干燥，100ul 20ug/ml RNaseA,37℃，30min；
    2倍体积无水乙醇沉淀，70%冷乙醇洗涤；
    干燥，溶于100ul TE。
三、真菌DNA提取方法
    SDS法：
    离心菌体，再用灭菌dd H2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到加有500ul提取液的离心管中，轻轻混匀；
    向管中加入50ul20%SDS溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组断裂，65℃保10min，并不时摇动；
    加入150ul 5mol/l KAc，混匀，置冰上20-30min;
    4℃，15000rpm离心15min，转移上清到另一离心管中，加入0.7V的异丙醇，混匀，-20℃沉淀30min；
    12000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀，吹干后加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA；
    加入1/10体积的RNaseA,37℃保温20min，除去RNA；
    加入等体积苯酚、氯仿抽提后加2V乙醇，-20℃沉淀30min。12000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀；
    用400ul70%乙醇洗一次后，吹干，加入等量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。

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