微生物分离培养技术全攻略

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微生物的分离是指将目标菌种从微生物群体（尤其是不同微生物群体）中分离出来的技术，是微生物实验最基本的技术。
微生物的分离培养方法主要有三种：划线分离法，涂布平板法和倾注平板法。后两种方法又可以同时进行计数，我们一起详细学习一下微生物分离纯化方法和技巧，微生物数量计数方法，一步步教你学习分离纯化技术，争取从实验室小白进军分离培养大师。一、划线分离法在无菌技术“规范”操作指南一文，提到过平板划线法，也就是划线分离法，我们巩固复习一次，温故而知新。1.定义：利用接种环将目标菌种在固体培养基表面划线，菌种逐步稀释，培养后能够长出许多单一菌落，从而达到菌种分离纯化的目的。2.目的：获得纯化的单菌落，越多越好。
3.操作步骤：(1)取菌种：取出目标菌种，融化后，备用；(2)接种针灭菌：灼烧接种针进行灭菌；(3)接种针冷却：将接种针移至酒精灯旁边冷却；(4)蘸取菌种：甘油管用75%酒精消毒，待酒精挥发完全，在酒精灯火焰略微灭菌（防止烤糊），然后用接种环蘸取一环菌种；(5)划线：取已经备好的固体平板，边转动平板边用酒精灯火焰灭菌，打开平板（靠口朝酒精灯），用上述接种环在平板上划线，先在一侧连续划线3-4次，边转动平板边用酒精灯灼烧接种环，冷却后，用接种环穿过第一次划线部分继续划线3-4次，同样方法进行第三次划线，或第四次划线（根据菌液浓度和菌种类型确定划线次数），灼烧接种环；(6)标记：在平板底部边缘处标记菌种名称，日期和其他信息；(7)培养：放置于恒温培养箱中培养；(8)保存：待培养完成后保存于4℃冰箱，待用。4.操作技巧：(1)甘油管菌种取出后，尽量不要放回去，或者标记清楚，反复冻融菌种效果不好。(2)灼烧接种针时，一定要烧红。要烧红！要烧红！要烧红！重要的事情说三遍，不烧红灭菌不彻底，容易污染，也可能出不来单菌落。
(3)烧红的接种针一定要冷却后再使用，如何确定接种针是否冷却？用接种针沿着固体培养基内侧边缘或不可能用到的区域“轻点”，试一下固体培养基是否能够融化，如果融化，说明温度过高，继续冷却；如果不融化，说明接种针已经冷却，可以使用。
(4)甘油管菌种的浓度直接影响到划线区域的分布，如何确定甘油管菌种浓度？第一种方法，事先查阅试验记录，确定甘油管菌种浓度。第二种方法，借助显微镜观察，粗略判断甘油管菌种浓度。第三种方法，测量吸光度，推测甘油管菌种浓度。
(5)划线过程，要求扫尾，扫尾出单菌落效果良好。但是，在实际操作中，很少人扫尾，因为有时候看不清尾部在哪，直接在附近区域划线，效果也不错。
(6)一定要标记清楚菌种信息和划线日期，一般情况在培养皿底部边缘处标记。5.注意事项：
(1)除样品外，所有试验都必须在无菌环境下进行，在打扫卫生、实验室消毒过程中，一定要做好个人防护。(2)试验过程中，一定要正确使用酒精灯，避免着火。(3)一定要在酒精灯旁边操作。(4)试验结束一定要将无关物品从超净工作台中取出，该灭菌的物品一定要灭菌后再处理，避免交叉污染。(5)试验过程中，尽量减少人员流动。(6)试验过程中，避免手部接触平板边缘，以免造成污染。(7)试验过程中，如果出现意外，比如说着火，别着急，拿上湿抹布覆盖即可。二、涂布平板法1.定义：待分离微生物样品经过一系列梯度（一般10倍递增）稀释后，使微生物菌体充分分散，成为单细胞，然后再取出一定量，涂布到固体培养基表面的方法，再经过适宜的培养条件，形成单菌落的过程。2.目的：(1)获得纯培养物-目标菌。(2)获得纯培养在微生物杂菌中的数量或比例—平板计数。