如何选择重组蛋白，蛋白标签有什么用？

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如何选择重组蛋白，蛋白标签有什么用？
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队长是我

前言
在之前的讨论中，我们已经详细了解了蛋白质修饰中的功能团添加。接下来，本文将深入探讨蛋白质标签添加领域中的两个关键类型：泛素化和SUMO化。

我们将详细解释这两种修饰的定义、它们在生物体内的添加过程，以及它们在细胞功能中的具体作用和实例。这将帮助我们更好地理解这些修饰如何在细胞调控中发挥关键作用。
01 蛋白质标签添加含义
蛋白质标签添加是蛋白质翻译后修饰的四大类型之一，涉及多种修饰方式，这些方式通过将小蛋白标签共价连接到目标蛋白质上，从而改变其功能。其中，泛素化和SUMO化是两种极为著名的蛋白质标签添加修饰类型。
02 泛素化
2.1 泛素化定义
泛素化涉及将小蛋白泛素（ubiquitin）附加到靶蛋白质的赖氨酸残基上，或者在某些情况下，附加到蛋白质的N-末端。这种修饰对蛋白质的稳定性、降解、细胞定位以及功能都有重要影响。泛素化可以是单泛素化（一个泛素分子被添加）或多泛素化（多个泛素分子被添加形成链）。
2.2 泛素化过程
泛素化修饰涉及泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的一系列反应。


泛素与E1连接活化
在ATP供能的情况下，酶E1粘附在泛素分子尾部的Cys残基上，激活泛素。这个步骤需要以ATP作为能量，最终形成一个泛素和泛素活化酶E1之间的硫酯键。
泛素与E2结合
E1将活化后的泛素通过交酯化过程交给泛素结合酶E2。
泛素通过E3与目标蛋白连接
泛素连接酶E3将结合E2的泛素连接到目标蛋白上。当目标蛋白上已经存在泛素时，E3酶仍然参与后续泛素分子的添加，形成多泛素链。E3酶的外形就像一个夹子，靶蛋白连接在中间的空隙内。酶的左侧结构域决定靶蛋白的特异性识别，右侧结构域定位E2酶以转移泛素分子。
2.3 具体实例
p53是一种重要的肿瘤抑制蛋白，其稳定性和活性受到严格调控。泛素化在p53的调控中扮演了关键角色。


p53的泛素化与转录抑制和出核
p53的泛素化与p53介导的转录抑制和p53出核是相关的。当p53被泛素化修饰后，其转录活性可能会受到抑制，并且p53可能会被从细胞核输出到细胞质中。
p53的多泛素化与失稳
p53的多泛素化与其失稳是相关的。多泛素化修饰通常会导致p53被蛋白酶体降解，从而降低其细胞内水平。
Mdm2介导的p53 C端泛素化
Mdm2是一种含RING指结构域的蛋白，可以发挥E3泛素-蛋白连接酶活性。Mdm2能够介导p53的C端泛素化，这对于p53的出核是必不可少的。
p53-泛素融合蛋白的定位
p53-泛素融合蛋白主要定位在细胞质中，这提示泛素化可能会引起蛋白的NES（nuclear export sequence）序列暴露出来，继而被CRM1（一种核输出调控因子）识别并从细胞核输出到细胞质中。
03 SUMO化
3.1 SUMO化定义
SUMO化（小泛素样修饰物化）涉及将小泛素样修饰物（SUMO）附加到蛋白质的特定赖氨酸残基上。SUMO是一类小蛋白，它们与泛素相似但结构和功能上有所不同。SUMO化在调控蛋白质的稳定性、亚细胞定位、转录调控和DNA损伤响应等方面起着重要作用。


3.2 SUMO化过程
SUMO化的生物化学反应过程与泛素化类似，涉及三个主要步骤和相关酶类，E3酶在这一过程中至关重要，因为它决定了SUMO化的特异性和靶标选择。
SUMO激活酶（E1）
在ATP水解提供能量的前提下，腺苷化的SUMO与E1活化酶（SAE1/SAE2）的半胱氨酸残基相连，形成高能硫脂键，从而被激活。
SUMO结合酶（E2）
激活的SUMO从E1传递到E2结合酶（Ubc9），与Ubc9位点半胱氨酸93位残基相连，形成SUMO-E2中间体。
SUMO连接酶（E3）
在E3连接酶的作用下，SUMO的甘氨酸与底物的赖氨酸侧链结合，形成异肽键，从而完成SUMO化修饰。3.2 具体例子
血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）是一种重要的受体酪氨酸激酶，在血管生成和肿瘤发展中发挥关键作用。VEGFR2的SUMO化是一个具体的例子，展示了SUMO化如何影响蛋白质的功能和定位。


实验设置
研究人员使用野生型内皮细胞（WT EC）和表达KDR-SUMO1的内皮细胞进行实验。在KDR-SUMO1细胞中，VEGFR2被SUMO1修饰。
观察结果
通过荧光显微镜观察，研究人员发现VEGFR2在KDR-SUMO1细胞中的定位发生了变化。与WT EC相比，VEGFR2在KDR-SUMO1细胞中显示出更强的胞浆分布，特别是在高尔基体周围的积累。
功能影响
VEGFR2的SUMO化促进了其在高尔基体的积累，这可能影响蛋白质的运输和功能，如其在细胞信号传导中的角色。这种改变在药物靶向和治疗策略的研究中具有潜在的重要性。

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队长是我

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过往案例

案例1：高纯度、低内毒素药用蛋白的规模制造
某药企客户需要低成本大量制备g级蛋白，要求纯度>95%，内毒素等残留达到药用蛋白水平，Hzymes采用平台优势大肠杆菌表达体系，开发了3步层析方案，表达量达到20mg/g湿菌，纯度>98%，内毒素含量<0.1EU/mg，单批次产能可达数百克，目前已稳定交付干万级订单。




案例2：高纯度、低残留分子酶的的合作共研

国内某知名分子诊断公司需要某款特种分子酶原料，酶原料序列已知，但客户表示在自行研发及样品生产过程中存在无法实现控温工艺开发、工艺放大困难、产品稳定性差、量产产能受限的情况直接影响到下游检测试剂及配套仪器开发。因此委托瀚海新酶参与合作共研，改进工艺并实施此款原料的量产。经工艺优化后，纯度提升至95%以上，比活力提升约1.8倍，批次间一致性高，单批次产能提升4倍以上，获得了客户的高度认可。

继续前进

大多数蛋白质都是利用重组表达技术进行制备的。在克隆的过程中，可以将额外的残基或标签添加到目标蛋白质的N端或C端。这些标签的长度可以从仅仅几个氨基酸残基到全长的蛋白质或结构域，它们可以提高目标蛋白质的产量或者赋予目标蛋白质新的特性，这些特性可以用来对目标蛋白质进行鉴定或者对目标蛋白质进行研究。



亲和层析标签



可溶标签

上述这些标签非常有用，其他标签同样能够与蛋白质融合而有着广泛用途（成像与定位研究的标记物、蛋白质检测和定量、蛋白质之间的相互作用研究、亚细胞定位或亚细胞转导等）。
标签的选择
亲和标签和可溶性标签在分子质量上差别非常大，因此它们给宿主细胞带来的代谢负担也有很大不同。例如，对一个具有100个氨基酸残基的融合有 MBP 标签（43 kDa）的目标蛋白质来说，要想获得1mg的目标蛋白质就必须表达5mg 的融合蛋白。亲和标签所要求的纯化费用也各不相同，有树脂本身的成本，也有操作过程中的花费（再生与再使用的难易、洗脱试剂、结合能力等）。除去费用因素，选择哪种亲和标签通常取决于适合目标蛋白质纯化的缓冲液。组氨酸标签不适用于某些对氧化作用和蛋白质水解损伤敏感的蛋白质的纯化，因为固相金属亲和色谱（immobilized metal affinity chromatographic, IMAC）的介质不耐受还原剂或EDTA。同样的，使用IMAC 介质纯化对金属离子敏感的蛋白质时也要非常小心。相反，如果目标蛋白质需要变性环境或需要重折叠，那么组氨酸标签和 IMAC 纯化方法就是很好的选择。
如何选择在N端还是在C端添加标签
标签既可以添加在靶蛋白的N端也可以添加在C端。在N端添加标签的一个优势是可以利用标签上的高效翻译起始位点。源于高表达蛋白质的可溶性标签，如MIBP、Trx和NusA，添加在N端时可以更加有效地提高靶蛋白的可溶性。在N端添加标签的另一个优势是可以完全去除这些标签，因为大多数内切酶的切割位点在C端或靠近识别位点的C端。
当添加标签时，需要注意保留信号序列的位点或者修饰位点。需要检查融合蛋白的末端序列以确定其对最终蛋白质产物稳定性的影响，尤其是检查N端的序列确认其没有符合宿主细胞 N 端规则（N-end rule）的降解信号。使用模式数据库，如 PROSITE，检查带有标签的蛋白质序列以发现因疏忽而引入的能够与别的蛋白质产生相互作用的序列或蛋白酶的切割位点。

检验医师

刚进入实验室的小伙伴，在接触重组蛋白的时候，是不是很头疼？
你想买 Human EGF 用于体外细胞培养，网上一查，相似产品超级超级多，眼花缭乱，该如何选择重组蛋白呢？
蛋白标签有啥用？有标签没标签有区别吗？
好吧，等你选择好了，拿到重组蛋白了，可是该怎么避坑使用呢？
重组蛋白怎么有效复溶及保存？
溶解过程中能采用涡旋震荡辅助溶解吗？
如何稀释重组蛋白？
不同重组蛋白之间是否可以交叉使用？




脑袋要炸掉咯

脑壳疼良方来咯！
本文将逐一破解上述疑问~
<hr/>Part 1：如何选择重组蛋白？





图 1. 重组蛋白表达步骤

重组蛋白选择，有几个重点选择标准，我给你们列出来了！
选择因素 1：研究目的

在选择产品前，明确实验目的，可排除一些干扰因素。



图 2. 重组蛋白表达体系的选择和对比

选择因素 2：产品特性

活性数据 (Biological Activity)
ED50 半数有效量 (Median effective dose, ED50) 在量反应中指能引起 50% 最大反应强度的药量，在质反应中指引起 50% 实验对象出现阳性反应时的药量。一般是通过其在标准化条件下对特定细胞类型的影响 (例如刺激细胞增殖) 来测量的。
小贴士：如何将 ED50 转换为比活力单位？
如下图，通过Human EGF 剂量依赖性刺激小鼠 BALB/c 3T3细胞增殖，ED50 <0.2 ng/mL。



一个活性单位是每毫升具有最大响应作用 50% 的细胞因子的数量：
Human EGF 1 个 unit (1U) 就是 0.2 ng/mL，每 1 mg 的 Human EGF 的活力值 (unit) 为:


即 Human EGF 的比活力为 5.0 × 106 units/mg。
计算当然也是有捷径的：
进入公众号 “MCE 抑制剂”-重组蛋白复溶计算器-比活力计算器
Part 2：重组蛋白如何复溶及保存？


由于工艺原因，蛋白冻干粉产品会呈现粉末状或肉眼不易观察到的透明薄膜状、胶冻状、雪花状，这些都是正常现象。冻干的体积大小也会受冻干前缓冲液组分、盐离子浓度、产品浓度等影响。此外，在运输过程中，冻干颗粒可能会分散，并粘附于瓶壁和瓶盖。
那么，如何更好地溶解重组蛋白呢~
第一步：开盖前需离心

在开盖使用之前，需先离心，将冻干粉收集于管底。
实验操作: 10,000-12,000 rpm 离心 30 s，若没有高速离心机，3000-3500 rpm，离心 5 mins。
第二步：产品复溶

还是以 Human EGF 为案例；10 μg 规格溶解
敲黑板：无论长期实验还是短期实验，溶解的浓度不低于 100 μg/mL！！
短期实验：
使用复溶 Buffer 直接溶解的重组蛋白，液体可在 2-8℃ 最长保存 1 周。对于周期较短的实验 (不超过 7 天)，可以直接取该条件下保存的细胞因子或者重组蛋白溶液加入到培养体系内即可，一周之内用完。(复溶 Buffer: 可参考重组蛋白使用指南里建议的溶液或者使用已贴心搭配好的蛋白伴侣）
长期实验：
以下步骤供参考：
1、先加 20-30 μL 建议复溶液



2、再加 70-80 μL 含载体蛋白 (0.1% BSA, 5% HAS, 10% FBS, 或 5% 海藻糖) 的缓冲液/培养基
3、分装大于 20 μL/管
第三步：产品保存

用复溶 Buffer 重悬的蛋白溶液用含载体蛋白 (0.1% BSA, 5% HAS, 10% FBS, 5% 海藻糖) 的溶液稀释后，-20℃ 可保存至少三个月。
Part 3：产品细节篇


以下一些小细节也要注意。

1、溶解过程中不要采用涡旋震荡辅助溶解

上期给大家说到：化合物的溶解可以借助水浴、超声、涡旋、震荡等方法助溶。但对于重组蛋白来说，具备一定的空间结构会使其活性更佳。
正确操作：移液器枪头轻轻吹打混匀或者上下颠倒混匀。若无法做到充分溶解，可以将复溶产品至于水平摇床低速摇一段时间或 4℃ 静置 2 h 以上。




2、稀释用的含载体蛋白的溶液选择

特别注意的是，稀释用的含载体蛋白的溶液是指有一定缓冲能力、pH 值为中性的溶液，如 PBS、培养液 DMEM 或者 RPMI1640 等。不可直接用水来代替。
3、不同重组蛋白之间是否可以交叉使用？

重组蛋白的种属交叉活性需要根据具体产品而定；建议尽量选择对应种属。如实在无法匹配种属：
a . 大多数人细胞因子对小鼠细胞有效 (仅少数例外)。
b. 干扰素，GM-CSF，IL-3，IL-4 具有种属特异性，例如重组人的这些细胞因子只能作用于人细胞，对小鼠和大鼠等其他种属无效果。
c. 成纤维细胞生长因子 (FGFs)、神经营养素 (Neurotrophins，如 BDNGF/GDNF/CNTF/β-NGF 等)、TGF-β 等高度保守，各种属间交叉活性强。
d. 同源交叉性的比对：打开蛋白数据库网站 Uniport，进行数据比对。以上信息仅供参考，毕竟文献是最好的老师。

4、有些蛋白带了标签，有什么作用？

重组蛋白的融合标签是在目的蛋白 N 端或 C 端进行融合表达的特定蛋白、多肽或寡肽标签。常用的标签有 His、GST、MBP、Trx、TF、MBP、Nus、SUMO、Flag 和 Fc 等。



常见的重组蛋白标签及作用

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