BCA 定量无误，WB 内参却仍未对齐：原因究竟何在？

生物科研实验室

一、BCA细节问题
1.细胞样品的PBS洗涤：确保在收样前用PBS充分洗涤细胞，以清除血清中的蛋白质残留。血清蛋白可能会影响BCA定量结果，导至Western Blot（WB）中内参不一致的问题。2.移液器的精确度：定期校准和维护移液器，确保其准确性。移液器的精准度直接影响实验的所有后续步骤，因此选择顺手且经过校准的移液器对实验至关重要。3.样品的完全裂解：使用涡旋混匀、超声等技术辅助细胞裂解，使其成为均匀的液体。在取上清液时，避免吸入沉淀，确保蛋白液的均匀性，以便准确进行BCA检测。4.96孔板操作的精准性：从标准曲线的R²值以及样品复孔间的差异可以评估移液器的使用技能。多练习小体积移液操作可以提高准确度，这对qPCR和其他小体积操作也有帮助。5.避免测量时的气泡：在加样过程中小心避免产生气泡，因为气泡会影响测量结果。孵育后大多数气泡会自消，但若仍存在，可使用沾有乙醇的注射器针头小心排除气泡。6.加样时的Loading Buffer控制：Loading buffer粘稠且容易粘附在枪头外壁。在吸取样品时，尽量减少枪头浸入液面的深度，避免击打时枪头侧面与样品管壁相接触，从而减少误差。7.蛋白煮沸后的处理：煮沸后，待样品冷却后进行离心，再放入冰箱储存。上样前，要用涡旋或离心混匀样品，确保样品均匀性，以便检测结果具有代表性。8.样品的冻融控制：尽量将蛋白样品保存于-20℃下并在1个月内使用。避免反复冻融，因为即使已煮沸的蛋白，长时间储存也可能导至降解。9.曝光时的均匀性：在进行曝光处理时，确保曝光液均匀覆盖在胶条上。若有任何干燥部分，条带会显得较浅，从而影响结果的可信度。
二、注意事项
1.加强实验操作的稳定性
对于新手，建议先练习并提高实验操作的稳定性。通过反复实验来确保BCA分析中内参的齐整性。如果在尝试后依然无法达成一致，或者在操作技术稳定后，可以尝试使用其他方法以加快实验进度。2.避免盲目重复失败操作
如果发现每次都在相同样品和上样量条件下，内参结果不一致，建议调整实验方法而非重复无效操作，避免浪费时间。可能需要回顾样品制备或上样方法。3.确保准确上样
在上样时一定要确保精确且不漏液到相邻孔。精确的上样操作对于保证结果一致性和可重复性至关重要。4.详细记录实验信息
每次实验时务必做好详细记录，包括样品的标记、上样量及相关条件等。避免依赖记忆进行操作，因为一旦忘记具体设置，之前所做的努力将可能白费。