PCR全家桶（PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR），科研新人看完秒懂！

非诚勿扰孟非

聚合酶链反应 （PCR） 是一种实验室核酸扩增技术，用于使用 DNA 聚合酶 I 酶对脱氧核糖核酸 （DNA） 或核糖核酸 （RNA） 序列的短片段进行变性和变性。1985年，Mullis及其同事引入了PCR，并因此获得了诺贝尔奖。它是生物分子科学中用于不朽的工具，因为它具有检查和检测 DNA 扩增成分的强大能力。
PART  1
基础知识（PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR）



图源: https://en.wikipedia.org/wiki

PCR：普通的聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction , PCR)），以双链DNA为模板，以dNTP为底物，特异性地扩增双链DNA。然后采用琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测，只能做定性分析。
qPCR：实时荧光定量PCR （real-time PCR, or qPCR），以cDNA为模板，以dNTP为底物，对扩增出的DNA进行定量分析。实时荧光定量PCR常用的方法：水解探针法和荧光染料法。
RT-PCR：反转录PCR（Reverse T ranscription - PCR , RT - PCR），将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增相结合，是PCR的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中首先经反转录酶将一条单链RNA逆转录成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。
RT-qPCR：实时荧光定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR, or RT-qPCR），是qPCR+RT-PCR的组合，将总RNA或mRNA逆转录成cDNA后再作为模板，以dNTP为底物，进行qPCR的定量分析。
PART  2
基础流程（PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR）
PCR流程：


变性Degeneration ：双螺旋的氢键断裂而变性解链变成单链DNA，成为合成DNA的活性模板；
退火Annealing：引物与模板DNA单链按碱基互补配对的原则结合，形成局部双链；
延伸Elongation：按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。


在经历一次变性→退火→延伸的流程之后，原本只有1条的DNA双链变成了2条；2次之后是4条；以此类推，经过变性、退火和延伸重复若干个循环后，就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

qPCR流程及分类：


qPCR在整个扩增的过程中，引入了荧光染料或者荧光基团，随着DNA数量的成倍增加，反应体系中的荧光信号也会增强。借助对荧光信号的强弱进行检测实时监测每一个循环中扩增产物量的变化，最后通过标准曲线和CT值对待测检测样品进行定量分析。
目前根据不同的荧光物质，我们可以大致将qPCR分为两种：荧光染料和探针法；



图片来源：SMOBIO Technology， Inc.

荧光染料：
主要为SYBRGreenⅠ染料，该染料能与DNA双链结合，结合之后会显示荧光信号，而在没有结合的时候几乎检测不到荧光信号，随着拷贝数的增加，荧光信号增强。
优点：价格较低；使用方便；对DNA模板没有选择，通用性好；检测灵敏度高。
缺点：可能产生假阳性结果，需要通过熔解曲线分析识别扩增产物的特异性；需要不断优化反应体系以降低非特异性扩增；不适合进行多重qPCR检测。
TaqMan探针法：
其原理是根据目的基因设计一个能与之特异性结合的荧光探针，该探针包含两个基团：一个荧光基团和一个淬灭基团，正常情况下因为淬灭基团的存在导致荧光基团无法发出荧光，而在扩增时探针结合到DNA的模板上，并且扩增到探针位置时两个基团被切开，从而荧光基团可以发出荧光，同样随着拷贝数的增加，荧光信号增强。
优点：检测特异性强；灵敏度高；适合进行多重qPCR检测；PCR后续无需处理，节省时间和原料成本。
缺点：需要根据不同的序列，合成不同的探针；探针的水解依赖Taq酶外切酶的活性，定量时容易受试剂和酶性能影响；淬灭难以彻底，成本较高；检测结果很难判断实际的扩增特性。

RT-PCR流程：


反转录PCR（Reverse Transcription - PCR，RT-PCR），是PCR的一种广泛应用的变形。RT-PCR 结合了反转录（Reverse Transcription）和聚合酶链式反应（PCR）的过程。
该技术的一般过程为，首先以RNA为模板在反转录酶的作用下合成其对应cDNA，再以cDNA为模板通过PCR进行DNA扩增。归根结底，其就是在PCR过程前加了一个反转录过程，之后即可进行普通PCR。


RT-qPCR流程及分类：


RT-qPCR是qPCR和RT-PCR的组合，因为RT-PCR只可以定性，但不能进行定量分析。与RT-PCR一样，RT-qPCR定量分析RNA也有两种方法：一步法和两步法。两种方法都需要先将RNA反转录为cDNA，然后再将其作为qPCR扩增的模板，只是一步法中的RT和qPCR在同一试管中进行，两步法中的RT和qPCR是按顺序分开进行。


一步法：
一步法RT-qPCR把逆转录与PCR扩增结合在一起，使逆转录酶与DNA聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应。一步法RT-qPCR只需要利用序列特异性引物。
优点：
1. 由于两步反应都在一个管中完成，因此该方法具有更少的实验误差；
2. 更少的移液步骤能够减少污染的风险；
3. 适用于高通量扩增/筛选，快速且可重现性高。
缺点：
1. 无法分别对两步反应进行优化；
2. 由于反应条件是结合两步反应折中得到的，因此灵敏性不如两步法；
3. 单一样品检测的靶点数较少。
两步法：
在两步法RT-qPCR中，逆转录和PCR扩增过程是在两个管中完成，使用不同的优化的缓冲液、反应条件、以及引物设计策略。
优点：
1.能够建立可以长期保存，并用于多次反应的稳定的cDNA库；
2. 靶基因和内参基因能够从同一个cDNA库进行扩增，而不需要多重cDNA库；
3.能够优化单一反应过程的反应缓冲液和反应条件；
4. 灵活的引发条件选择。
缺点：
1. 使用多个试管，以及更多的移液步骤会增加DNA污染的风险，并且耗时；
2. 相较于一步法，需要进行更多的优化。
PART  3
总结及产品推荐
总结：
PCR、qPCR、RT-PCR和RT-qPCR这四种技术的主要区别在于它们的应用领域和检测目标不同。PCR主要用于DNA序列的扩增和检测；qPCR可以实时定量检测DNA或cDNA的含量；RT-PCR主要用于RNA分子的扩增和检测；而RT-qPCR则结合了RT-PCR和qPCR的技术，可以对RNA分子进行定量分析。
产品推荐：
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qPCR/RT-qPCR试剂：


PCR相关耗材：


PART  4
参考文献
[1] Ramesh R, Munshi A, Panda SK. Polymerase chain reaction. Natl Med J India. 1992 May-Jun;5(3):115-9.
[2] Lorenz TC. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. 2012 May 22;(63):e3998.
[3] Ghannam MG, Varacallo M. StatPearls [Internet]. StatPearls Publishing; Treasure Island (FL): Jul 30, 2023. Biochemistry, Polymerase Chain Reaction.
[4] Artika IM, Dewi YP. Real-Time Polymerase Chain Reaction: Current Techniques, Applications, and Role in COVID-19 Diagnosis. Genes (Basel). 2022 Dec 16;13(12):2387.
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