Western Blot

虎威将军

一 细胞裂解液


二 配胶
聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性（Native-PAGE）和变性（SDS-PAGE）。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）是在不加入SDS等变性剂和巯基乙醇、DTT等还原剂的条件下，对非变性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。Native-PAGE在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态和电荷，它们的分离依据其自身的电荷量和空间结构的不同，以及凝胶的分子筛作用而逐渐呈梯度分开，因而可以得到较高的分辨率，常用于研究一些蛋白的二聚体或多聚体等。
Western Blot检测时，相对广泛采用的是SDS-PAGE。对于SDS-PAGE，是在电泳体系中加入变性剂SDS和还原剂DTT或者巯基乙醇等。蛋白质分子的多聚体或者高级结构会被打开，蛋白质氨基酸侧链和SDS结合形成蛋白-SDS复合物，所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的电荷量，因此可以有效消除不同蛋白质分子间的电荷差异和空间结构差异。所以SDS-PAGE检测时，可以利用分子筛效应将蛋白质依据分子量大小分离开来。
SDS-PAGE一般采用不连续缓冲系统，即由分离胶和浓缩胶构成，这样对蛋白质的分离除了分子筛效应外，还有堆积效应，将较稀的蛋白样品经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。不连续缓冲系统的分离胶可以是均一胶，也可以是梯度胶。


三 转膜
转膜，顾名思义，是将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体上，同时维持其相对位置和分辨率的过程。
转膜方式主要有两种：湿转和半干转。两者原理相同，只是用于固定胶/膜叠层及施加电场的仪器有不同。半干转耗时短，但是更适合小分子蛋白的转印，而湿转蛋白分子量范围较宽，两者的比较见表1，在Western Blot实验中，常用的是湿转。

湿式转印系统	半干转印系统
小分子、大分子蛋白均可轻松转移	比较适合转移小分子蛋白（<120kD）
转膜时间一般较长	转膜时间一般较短

表1.两种转膜方式的比较：
1转印膜的选择
杂交膜的选择也是Western Blot实验中一个重要的环节，需要根据杂交方案，被转移蛋白的特性及蛋白分子量大小等条件去选择合适材质、孔径和规则的杂交膜。Western Blot实验中最常用的转印膜有两种：PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）和NC膜（硝酸纤维素膜）。
NC膜对于分子量较小的蛋白质会在洗涤时丢失，且NC膜韧性较差，易损坏，操作室容易卷，对操作的技巧要求较高；而PVDF膜在机械强度和化学相容性上都具有更优越的性能，且灵敏度高、分辨率和蛋白亲和力较其他的膜要高，非常适合分子量较小的蛋白质检测，但是需要甲醇预先活化，成本较高。
对于两种膜的比较，详见表2。

PVDF膜	NC膜
机械强度高，质地柔韧，易于保存	脆而易碎
化学稳定性好，耐腐蚀，不易降解	溶剂不耐受
蛋白结合能力相对较高	蛋白结合能力相对较低
可用于多次剥离和杂交	不利于多次剥离和杂交
需要甲醇等溶液浸泡预湿活化	不需要预湿处理
价格较高	价格较低

表2.两种常用转印膜的比较
选到合适材质的膜之后，还需要根据需检测蛋白的大小，选择合适的膜孔径。Western Blot转印膜通常有两种孔径大小：0.2μm和0.45μm。
0.2μm ：特别适合小于20kD的蛋白；推荐用于低丰度蛋白检测。
0.45μm：更加常用，适合大于20kD的蛋白；比表面积较小，背景较低。
转膜操作
1.转膜液的配制
转膜之前先提前配好1x转膜液，也可以直接购买碧云天配制好的的Western转膜液(P0021A/P0021B)，提前放在4℃冰箱或冷库进行预冷处理。
2.PVDF膜活化
将膜产品浸润在甲醇或安全无毒的碧云天PVDF膜浸润活化液（P0021S）中活化，保证膜由不透明变成透明，然后小心将膜放入提前配好的转膜液中平衡。如果使用活化液，只需简单地用转膜液洗涤数秒，即可被快速平衡并用于后续的转膜等实验。
3.转膜装置的组装
在加有转膜液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子（E6065）、两块 转移衬垫（E6061）、滤纸（FFP51）和已经活化好的膜。将夹子打开使黑的一面保持水平。然后依次放入转移衬垫（海绵垫）-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-转移衬垫（海绵垫），制成“三明治”结构。
整个操作在转膜液中进行，并使用专业赶气泡滚子（E6071）滚动赶走气泡，要保证夹子、海绵垫、滤纸、胶、膜之间没有气泡。将夹子夹好后放入转移槽中，要使夹子的黑面对槽的黑面，夹子的白面对槽的红面。


转膜夹子放入槽中后，加入足够的转膜液，盖上盖子，插好电源，准备转膜。
转膜时会有比较明显的产热现象，并导致转膜液的电阻变小，最终影响转膜效率、转膜液的缓冲能力、甚至过热导致凝胶熔化或黏附在膜上。因此建议转膜时，在转膜槽内用冰盒（E6069）降温，并将转膜槽置于冰浴中。
4.转膜时间
对于湿转法：一般转膜的电流在200mA-400mA之间，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。大片段的>50KD的可以选用350mA,小片段的可以用250mA。
具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。

特别提醒：
转膜流程的详细说明可在转膜仪器制造商的网站上找到，根据系统的不同而有所区别。但是，每种方法的原理都一样。带电荷的蛋白（SDS 提供）在电场中可以在凝胶中移动，从凝胶转移到膜上，显示蛋白的“印迹”。早期的方法依赖于扩散；现在在电场中进行印迹是标准方法了。
转膜可以湿转或半干转。湿转由于膜的干燥而更不容易失败，尤其推荐用于大蛋白转膜。在两种转膜方法中，膜都放置在凝胶旁边，两者夹在滤纸中间，整个三明治结构夹在固体载体之间，保持凝胶与膜之间的紧密接触。
在湿转中，凝胶和膜紧紧地夹在海绵和滤纸之间（海绵 > 滤纸 > 凝胶 > 膜 > 滤纸 > 海绵），确保凝胶与膜之间不形成气泡。三明治结构浸泡在转膜缓冲液中，对其施加电场。负电荷蛋白向正极移动，结合在膜上，并阻止其继续移动。
湿转的标准缓冲液与跑胶缓冲液所用的都是 1x Tris-甘氨酸缓冲液，但是没有 SDS，并加入了甲醇至终浓度 20%。对于分子量大于 100 kDa 的蛋白，推荐在转膜缓冲液中加入终浓度为 0.1% 的 SDS。
在半干法转膜中，三明治由滤纸 > 凝胶 > 膜 > 滤纸组成，在转膜缓冲液中浸湿，直接放置在正负电极之间。在转膜中，膜靠近正极、凝胶靠近负极，这很重要。
半干转的转膜缓冲液中 Tris 和甘氨酸的比例不一定与湿转一致，请参考仪器制造商的实验方案。标准配方是 48 mM Tris、39 mM 甘氨酸、0.04% SDS、20% 甲醇。
有两种类型的膜：硝酸纤维素膜（NC膜）和 PVDF膜，实验效果都很不错。PVDF 膜要求进行预处理：将膜裁剪为合适的大小，然后在甲醇中浸泡 1–2 分钟。之后转移膜至冰冷的转膜缓冲液中孵育 5 分钟。未能在转膜缓冲液中平衡的膜会导致转印时皱缩、条带错位。
小分子和大分子蛋白的转膜
转膜缓冲液中 SDS 和甲醇的平衡、蛋白的大小、胶的浓度会影响转膜效率。如下调整可以增加转膜效率：
大分子蛋白 (>100 kD)
对于大分子蛋白，其在凝胶电泳时分离迁移较慢，从凝胶中转膜也很慢。因此跑胶时应该使用低浓度的凝胶，8%或更低。由于低浓度的胶易碎，所以操作时需十分小心。

• 大分子蛋白易在凝胶里形成沉淀聚集，阻碍转膜。在转膜缓冲液加入终浓度0.1%的SDS，可以避免出现这种情况。由于甲醇易使SDS从蛋白上脱落，因此降低甲醇的浓度至10%或更低，可以防止蛋白沉淀。
  
• 降低转膜缓冲液中甲醇的比例也会促使凝胶的肿胀，让大分子蛋白更容易转膜。
  
• 只有使用NC膜时才必需使用甲醇。如果是 PVDF膜，在甲醇激活膜后，转膜缓冲液中可以不加入甲醇。
  
• 选择湿转 4°C 过夜，不建议选择半干转。​
  

小分子蛋白 (<100 kD)
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• SDS 妨碍蛋白与膜的结合，对于小分子蛋白更是如此。因此小分子蛋白的转膜，转膜缓冲液中可以不加 SDS。
  
• 保持甲醇的浓度20%。
  

对于500 kD 的蛋白，请参考下列文献的凝胶和缓冲液系统：
Bolt MW and Mahoney PA (1997).High-efficiency blotting of proteins of diverse sizes following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis.Anal Biochem​, 247, 185–92.
更多转膜提示：

• 使用镊子，避免手指接触膜。手指上的油和蛋白会阻碍转膜，形成脏的印迹。
  
• 将凝胶和膜夹在滤纸中间后，两者之间的气泡可以通过滚筒、移液管或者 15 mL 管滚压三明治结构来去除，或者在装有转膜缓冲液的盘中组装三明治结构，防止气泡形成。
  
• 确保将滤纸和膜的大小剪裁得与凝胶一致。在半干转中，较大的突出会阻止电流通过膜。
  
• 鸡来源的抗体会结合在 PVDF膜上，形成高背景。改用NC膜可以帮助降低背景染色。
  

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