分不清siRNA、shRNA和sgRNA？速看这篇！

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在基因表达调控中，siRNA、shRNA和sgRNA扮演着举足轻重的角色，它们对于调控基因表达、剖析基因功能以及开创新型治疗手段具有不可估量的价值。尽管它们的目标趋同，即通过遏制或修改特定基因的表达来调控细胞机能，但在构造、作用原理和应用场景上却各具千秋。
siRNA以其直接和高效的特点在短期基因沉默实验中大显身手；shRNA则凭借其持久和稳定的特性在需要长期基因沉默的研究中独占鳌头；而sgRNA则以其精确和高效在基因编辑和基因功能探究中发挥着核心作用。
siRNA（小干扰RNA）siRNA是一种由约21-25个核苷酸组成的双链RNA分子，它通过与靶基因的mRNA结合，促使mRNA降解，从而阻断特定基因的表达。siRNA通常由Dicer酶从长双链RNA中剪切产生，随后与RISC（RNA诱导的沉默复合体）结合，形成活化的RISC复合物，进而精准识别并降解靶mRNA。
作用原理：siRNA的作用旅程始于与RISC的结合。一旦结合，RISC复合体被激活，其中的引导链会指引RISC复合体找到并绑定到互补的mRNA上，而乘客链则被分解。RISC复合体中的酶活性会导至mRNA被切断，从而阻止基因的翻译进程。
操作流程：
针对目标基因设计并合成siRNA序列。
将siRNA导入细胞内部。
siRNA与RISC结合，形成具有活性的RISC复合物。
RISC识别并结合mRNA，导至mRNA降解。
siRNA的显著特点在于其直接和高效。siRNA通常在体外合成后，通过转染或病毒载体迅速导入细胞并发挥作用。然而，siRNA在细胞内的效果往往是暂时的，其抑制效果随着siRNA的分解和稀释通常在数日内逐渐减弱。因此，siRNA更适合用于短期的基因沉默实验，如快速验证基因功能、药物靶点确认以及基础生物学研究。由于其作用的暂时性，siRNA也常被用于高通量筛选实验。
shRNA（短发夹RNA）shRNA被巧妙设计成能形成发夹结构，一旦进入细胞，shRNA会被Dicer酶切割成siRNA，随后与RISC结合，进一步识别并降解靶mRNA，从而有效抑制特定基因的表达。shRNA通常用于创建稳定的基因敲除细胞系或转基因动物模型。
作用原理：shRNA的作用机制与siRNA相似，但shRNA首先需要在细胞内被Dicer酶切割成siRNA。这些siRNA随后与RISC结合，形成活化的RISC复合体，识别并降解靶mRNA。
操作流程：1. 设计并构建携带shRNA的表达载体。
2. 将shRNA表达载体通过转染或转导方式导入细胞或动物模型中。
3. shRNA在细胞核内形成发夹结构，被Dicer酶切割成siRNA。
4. siRNA与RISC结合，形成具有活性的RISC复合物。
5. RISC识别并结合mRNA，导至mRNA降解。

shRNA的突出优势在于其持久和稳定。由于shRNA通过DNA载体表达，可以整合到宿主细胞的基因组中，实现长期稳定的表达，特别是当使用整合性病毒载体时，这种效果更为显著。因此，shRNA更适合用于需要长期基因沉默的实验，如构建稳定表达的基因敲除细胞系或转基因动物模型。shRNA的持续表达使得基因沉默效果更为长久。
sgRNA（单指引RNA）sgRNA，即单指引RNA，是CRISPR-Cas9基因编辑系统中的关键组成部分。它是一种由大约100-200个核苷酸组成的单链RNA分子。sgRNA由两部分构成：一部分是约20个碱基的靶向序列（间隔区），与目标DNA序列完全匹配；另一部分是结合域，与Cas9蛋白紧密结合。这种设计使得sgRNA能够精确指引Cas9酶定位到基因组中的特定位置。
作用原理：sgRNA的作用始于其间隔区序列与目标DNA的完全匹配。当sgRNA与Cas9蛋白结合时，它引导Cas9到达特定的DNA序列，这些序列通常位于PAM（原间隔序列邻近基序）附近。Cas9酶在PAM序列上游约3个碱基处启动DNA切割，造成双链断裂（DSB）。这一过程是基因编辑的关键环节，因为它允许后续的DNA修复机制介入，无论是通过非同源末端连接（NHEJ）还是同源重组修复（HDR）。

操作流程：1. 利用在线工具或软件精心设计sgRNA序列，确保其特异性和高效性。
2. 将设计的sgRNA序列克隆到表达载体中，并与Cas9蛋白编码序列一起构建成基因编辑系统。3. 将构建好的sgRNA和Cas9表达载体共同导入目标细胞中，可以采用电穿孔、脂质体介导转染或病毒介导转导等方法。4. 通过分子生物学技术（如PCR和测序）筛选并验证基因编辑效果。

应用实例：sgRNA在基因编辑和基因功能研究中发挥着举足轻重的作用。其精确性和高效性使其成为研究基因功能、开发基因治疗策略以及农业遗传改良等领域的重要工具。例如，在研究特定基因的功能时，通过sgRNA介导的基因敲除可以精确地关闭目标基因，观察细胞表型的改变。
三者对比与总结本质差异：siRNA和shRNA主要用于降低基因表达水平，它们通过降解mRNA来抑制特定基因的表达。而sgRNA则用于基因的敲除操作，通过指引Cas9蛋白切割DNA双链，实现基因的永久性改变或插入新的遗传物质。
应用选择建议：根据具体的实验需求选择合适的RNA分子至关重要。对于需要短期基因沉默的实验，siRNA是理想选择；对于需要长期稳定表达的基因沉默实验，shRNA更为合适；而对于需要精确基因编辑的实验，sgRNA结合CRISPR-Cas9系统无疑是最佳选择。