手把手教会荧光共定位分析

检验之星

文/半夏
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ImageJ（https://imagej.nih.gov/ij/ ）是美国NIH基于Java开发的免费图像处理软件。今天的主题是共定位分析，那么什么是共定位（Colocalization）？从物理角度来看，它意味着两种或多种颜色荧光分子发出的颜色占据图像中的相同像素。在生物学上，共定位是指两个或多个不同分子位于细胞中的同一结构。

在数字成像的背景下，它可以被描述为多通道图像中的两种或更多荧光染料在空间重叠。共定位对于确定感兴趣结构的位置必不可少，当我们发现某一蛋白在细胞中其重要作用时进一步研究其在何处与何分子结合发挥作用显得尤为重要。话不多说， 应大家要求今天给大家分享使用ImageJ分析荧光共定位。

免疫荧光荧光染料的选择荧光避免串色，保存为tiff或者共聚焦格式图片（如.lsm）避免图像信息丢失。荧光图像的背景取决于多种条件，包括显微镜因素以及荧光染料荧光强度等。为保证结果有可比性，所有图片应该使用相同的条件拍摄。

1、荧光共定位定性表示方法

广义来说共定位指不同荧光代表的不同蛋白在同一空间位置分布，例如两个蛋白都定位于轴突或树突，在ImageJ中可通过Plot Profile工具得到的随着划线distance荧光的灰度值来实现。



对于上图还可以和大家聊聊关于荧光拍摄过曝的问题，我们知道灰度值0是纯黑，255是纯白。对于上图rab7-GFP与beclin 1，随着distance变化有一截图像是平的


，从纵坐标可以看出大概在255左右，说明此处存在过曝。简单来说本来灰度有差异的荧光点都变成了饱和的最大值255，也许有些值本来是233也变成了255，差异就不会被显现出来，因此荧光图片拍摄不能过曝。如上所述，Plot Profile也可以用来判断荧光图片有无过曝。

扩展

蔡司共聚焦Zen2009软件也可在拍摄图像后在Profile下划线来判断图像是否过曝：



在ImageJ菜单下Analyze，Plot Profile（快捷键Ctrl+K）可以找到Plot Profile工具。



Plot Profile只适用于线（Line）和矩形（Rectangluar）选框，表示线段和矩形选框所经过的范围内的灰度变化：



对于仅含有红绿蓝三通道RGB格式荧光图片，可在ImageJ菜单下Image，Color，Split Channels，得到Red，Green，Blue三通道的图片。含有除红绿蓝三通道以外的RGB格式荧光图片，无论有多少个通道也只能拆分出红绿蓝三通道，因此需要拍摄的时候保存为多通道图片。组合通道Image,Color,Merge Channels后可以得到多通道的荧光图片。



此时再使用使用划线工具


或者矩形工具


分别对对应荧光通道进行Plot Profile，分别得到矩形范围内荧光强度变化，导出数据绘图即可。

2、三维共定位

二维图片的共定位可能是假的共定位，也许空间位置上毫无关系。例如下图二维图片，我们从上往下看会发现红色与绿色通道完全Merge，看到一个完全黄色的椭圆形，但其在二维图片拍摄位置两种荧光实际上相差十万八千里,从三维位置看就不难发现其没有共定位：





对于层扫（Z-Stack）荧光图片，如下图所示三维共定位是某一位置在三维空间上存在共定位。



方法为打开层扫荧光图片在ImageJ主菜单上点击Image，Stacks，Orthogonal views，就可以看见和文献中相同的正交视图，即显示XY,XZ,YZ视图，XY视图中的黄色十字可以用鼠标拖动。

扩展

蔡司共聚焦Zen2009软件也可达到相同效果：



Ortho为显示正交视图，从xy，xz，yz来显示图片：



3、共定位定量分析

文献中（doi: 10.1038/srep01365）使用共定位分析产生的散点图表示共定位程度，散点图越接对角线共定位程度越高。文献展示这种共定位散点图的意义是数据可以伪造，但我们一般伪造不出共定位散点图的分布。



双尾分叉形状的共定位散点图共定位效果差：



共定位定量指标及其意义：



使用工具——Colocalization Finder：



插件下载与安装：
下载地址：https://imagej.nih.gov/ij/plugins/colocalization-finder.html  
将下载插件 Colocalization_Finder .jar  放于plugins文件夹重启软件在Plugin即可找到Colocalization Finder。

使用方法：
打开待分析图片：



Image，Color，Split Channels，得到Red，Green，Blue三通道的图片：



点击Plugin，找到Colocalization Finder，分析red通道与green通道的共定位情况，点击OK：



得到共定位散点图、共定位数据（意义见上表）等：



Pearson’s_Rr系数为0.07980265非常低，而共定位散点图也不是对角直线甚至存在分叉，几乎没有共定位。但值得注意的是其重叠系数Overlap_R却高达0.9599，提示我们我们肉眼认为的重叠和共定位存在很大的差别，应该以软件定量计算结果为准。

对于共定位的统计分析，看看文献中是如何做的：



文献中统计了共定位Pearson’s系数与重叠系数。如前所述，共定位散点图结合共定位系数的统计，结果将非常可信。

此外JACoP也可以进行共定位分析，使用方法类似，大家可以根据需要自行学习：



4、荧光Ratio




荧光比值计算pH值。两通道荧光图片进行比值即可，方法为：
Process下，选择Image Calculator，Image1 Divide Image2即可：



ImageJ分析荧光共定位今天就分享到这里，希望对大家有所帮助，祝大家实验顺利。

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