立即注册找回密码

QQ登录

只需一步,快速开始

微信登录

微信扫一扫,快速登录

手机动态码快速登录

手机号快速注册登录

搜索

图文播报

查看: 119|回复: 2

[分享] 大家做动物组织Western Blot都会做BCA定量吗?

[复制链接]
发表于 2025-1-15 15:57 | 显示全部楼层 |阅读模式

登陆有奖并可浏览互动!

您需要 登录 才可以下载或查看,没有账号?立即注册 微信登录 手机动态码快速登录

×
从去年7年开始,一直在陆陆续续跑动物组织蛋白WB,采用的方法是课题组传下来的:就是先按照一定质量比如30mg,称取动物组织蛋白后,加裂解液,用钢珠研磨后离心取上清,然后蛋白变性后直接等体积上样比如都上5微升,再根据跑出来的actin内参灰度值调整一下上样体积,让内参尽量齐一点。 相当于跳过了BCA定量这一步。 但我觉得相比于细胞提的蛋白,动物组织蛋白真的好难跑,有时候连actin都不稳定,最近跟周围同学交流了,他们跑得好的都会做一下BCA蛋白浓度定量。但诡异的是,我同组师姐她们一直不BCA定量,直接跑了再根据条带调内参,似乎也出了很多结果,条带也还行。 之前我一直想不明白为啥我也用她们传下来的方法,就是WB经常翻车。  不知道知友们跑动物组织WB,都会定量吗?不定量能跑出好看的条带吗?最后,再放几张最近跑的有点辣眼睛的条带,谢谢大家关注~





原文地址:https://www.zhihu.com/question/634455151
楼主热帖
回复

使用道具 举报

发表于 2025-1-15 15:58 | 显示全部楼层
建议还是用BCA测浓度后再跑。通过灰度统计来反向调整上样体积算是预实验吧,而且每次对不同样品用不同上样体积,在调整的时候会容易出错,大大增加了实验的偶然性,尤其是对做实验不是特别熟练专注力不强的。
回复 支持 反对

使用道具 举报

发表于 2025-1-15 15:58 | 显示全部楼层
什么是蛋白定量?
蛋白定量是蛋白分离和分析前必须的一个重要步骤,蛋白色谱分离、蛋白质电泳分析、蛋白质免疫分离和分析、细胞裂解释放的总蛋白定量、蛋白分子的标记、蛋白结构分析等,都需要可靠的定量分析作为基础。蛋白定量分析应用的领域包括生物科学,食品检验,临床检验等等。
每种蛋白定量方法都有其局限性,而这取决于应用和分析的特定蛋白本身。在选择蛋白定量方法时,需要考虑的特性是:灵敏度(较低的检测限)、与样品中常见物质的相容性(例如,去污剂剂、还原剂、抑制剂、盐和缓冲等)、标准曲线的线性度和蛋白质间的差异。
蛋白定量有哪些方法?
一、比色法
蛋白定量常使用的方法是比色法,通常用于总蛋白的定量分析。根据蛋白和比色试剂的结合,可以将比色法分为:蛋白-染料结合法蛋白-铜螯合化学试剂法
前者对应的典型蛋白定量比色法是考马斯亮蓝G250染料结合法,后者则包括双缩脲法,Lowry法,二喹啉甲酸(BCA)法。
1、 Bradford法
Bradford法也称作考马斯亮蓝法,是由Bradford于1976年建立的。该方法的原理是蛋白在酸性条件下和考马斯染料结合,染料的最大吸收值发生改变,从465nm转移为610nm,并且在595nm处有最大的吸收差异。结合到蛋白质分子上的染料数与蛋白所带正电荷成正比,因此可以用该方法来对蛋白进行定量。染料的颜色变化和蛋白中的碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)有关,另外范德华力和疏水作用也会影响蛋白与染料的结合。




特点:简单便捷、灵敏度高,GBCBIO品牌的蛋白质定量试剂盒(Bradford法),线性标准曲线范围为50-1000 ug/ml,灵敏度25ug/ ml,最低检测蛋白量达到0.5ug。反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量。Bradford 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响,如:K+ 、Na+ 、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、EDTA、DTT、TCEP 和β-巯基乙醇等。
需要注意的是:由于高浓度洗涤剂会影响检测结果的可靠性,必须确保样品中的SDS的浓度低于1%,Triton X-100低于0.1%,Tween 20,60,80低于0.06%,以及检测蛋白浓度的考马斯亮蓝和染色PAGE胶的考马斯亮蓝不是同一种物质,前者采用考马斯亮蓝G250,后者采用考马斯亮蓝R250,G250和R250分子基本骨架一样,但是G250多了两个甲基,与蛋白反应迅速,染胶慢且脱色困难,故用于蛋白定量;R250与蛋白反应较缓慢,染胶较快且易于洗脱,故用于PAGE胶染色。
2、 BCA法
BCA (bicinchonininc acid) 1985年Paul K. Smith等人开发出BCA方法,该方法分为两步:首先,在碱性条件下,蛋白将二价铜离子还原为一价铜离子,然后,BCA和一价铜离子结合,形成紫色化合物,该化合物在562nm时有最大吸收,且吸收值与蛋白浓度呈线性相关。




特点:灵敏度高,操作简单,正常情况下可在45分钟内完成测定;且试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳。需要注意的是这种方法需要提前制作标准曲线。GBCBIO品牌定量总蛋白的蛋白质定量试剂盒(BCA法),线性标准曲线范围为50-2000 ug/ml,灵敏度25ug/ ml,最低检测蛋白量达到0.5ug。
实验所需仪器及试剂:恒温水浴锅、可见光分光光度计、离心机、旋涡混合器、试管
操作步骤:
1.标准液制备:梯度稀释牛血清白蛋白(BSA)标准品。将8个EP管按照1到8进行标记,将BSA标准品稀释成1mg/mL工作液,准备浓度梯0,50,100,200,400,600,800,1000 ug/mL。
2.BCA工作液制备:将A液和B液摇晃混匀,按照A:B=50:1的比例配置BCA工作液,充分混匀。(BCA工作液室温下24h内稳定,故现用现配)
3.加样孵育:吸取20μL各个稀释浓度的蛋白质标准品或待测蛋白质样品,加入96孔板底部或试管中,向孔/管中再加入200uL BCA工作液轻轻摇晃混匀。在37°C下孵育30min,冷却至室温。
4.测定:冷却到室温后,以空白为对照,测量样品在562nm或该波长附近的吸光值
5.将各个标准品和待测蛋白质样品在562nm处的吸光值减去空白标准品在562nm处的平均吸光值。
浓度计算:
1.在excel表中输入对应的标准曲线值和蛋白样品值。(图中所示均为举例说明),选定标准曲线的OD值和标准品蛋白浓度。


2.点击excel表栏:插入-图表-XY散点图,并点击确定。


3.点击确定后会自动生成XY散点图,随意点击散点图中的任一的散点,右键添加趋势曲线。


4.点击趋势线的拓展栏,选择“更多选项”


5.选择“更多选项”,弹出“设置趋势图格式”的画面,点击“显示公式(E)”以及“显示R平方值”。一般R2值越接近1,表现标准曲线做得越好,根据标准曲线带入的样品OD值测出的蛋白浓度也越准确,一般要求为0.99几左右。


6.将样品OD值代入标准曲线的公式中,计算即得到待测样品蛋白的浓度。
二、紫外法
紫外法也是常用的蛋白定量方法之一,该方法在简单的分光光度计中就可以定量测定溶液中蛋白质的含量。蛋白质对近紫外光的吸收依赖于酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)含量,同时在很小的程度上也会受到苯丙氨酸(Phe)和二硫键数量的影响。因此,蛋白质之间A280的吸收值相差很大,对于浓度为1 mg/mL的溶液,从0到4的数值都有,大多蛋白的吸收值在0.5 - -1.5的范围之间。
三种方法的优缺点比较




大家可以根据以上介绍,从不同方法的优缺点考虑,选择合适自己的方法,对蛋白进行定量分析。
声明:部分图源网络,侵权联删
整合了网上诸多资料,因此未能一一注明出处。如有侵权,请联系作者删除。
捷倍斯生物官网:http://www.gbcbio.cn/
蛋白定量试剂盒推荐

样品类型推荐试剂(品牌+货号)
/Bradford Protein Assay Kit(GBCBIO-G3155)BCA Protein Assay Kit(GBCBIO-3522)
回复 支持 反对

使用道具 举报

发表回复

您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册 微信登录 手机动态码快速登录

本版积分规则

关闭

官方推荐 上一条 /3 下一条

快速回复 返回列表 客服中心 搜索 官方QQ群 洽谈合作
快速回复返回顶部 返回列表