如何对血清或血浆进行western blot实验

生物科研实验室

蛋白质印迹（Western blot）是一种技术，用于测定血清或血浆中特定蛋白质的含量。执行蛋白质印迹实验时，首要步骤是对血清或血浆样本进行预处理。操作流程如下：首先，对血清或血浆样本实施常规离心，以获取上清液。这通常需在3000转/分钟的速度下离心15分钟。
随后，测定血清或血浆中的蛋白质浓度，以便确定后续处理所需的蛋白质量。
将血清或血浆样本用蛋白质裂解液或磷酸盐缓冲液（PBS）稀释到目标浓度，一般为5微克/微升。建议在预先的实验中测试不同的上样量范围，以取得最佳成效。
最后，加入适量的上样缓冲液，并在100摄氏度的温度下加热5分钟，确保蛋白质充分变性并准备好进行电泳分离。
以上是血清或血浆蛋白质印迹实验前的预备步骤，这些操作有助于保障实验的精确性和可重复性。
进行血清或血浆的蛋白质印迹实验通常涵盖以下几个环节：1.样本制备血清或血浆的分离：血清：采用非抗凝管采集血液，静置至血液凝固，然后以3000转/分钟离心15分钟，取上清作为血清样本。
血浆：使用乙二胺四乙酸（EDTA）等抗凝剂处理血液样本，在4摄氏度的条件下以4000转/分钟离心5分钟，取上层清液作为血浆样本。
蛋白质浓度测定：运用二辛可宁酸（BCA）法或其他适宜的方法测定蛋白质浓度，保证样本浓度适宜后续实验。
2.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）样本制备：将血清或血浆样本与4倍浓度的上样缓冲液混合，在100摄氏度的条件下加热10分钟，然后迅速冰浴冷却。
电泳：根据蛋白质浓度，通常每孔上样20-40微克的蛋白质。电泳过程中，初始使用低电压（80伏）进行浓缩胶的电泳，待溴酚蓝进入分离胶后提升电压（120伏）直至电泳结束，当溴酚蓝抵达凝胶底部附近时停止。
3.转膜转膜准备：选用聚偏二氟乙烯（PVDF）膜或硝酸纤维素膜，PVDF膜需在甲醇中浸泡活化。将膜和滤纸置于转膜缓冲液中浸泡。
转膜操作：将电泳后的凝胶、膜和滤纸按顺序叠放，确保无气泡。利用电泳装置进行转膜，转膜时间和电流需根据目标蛋白质的分子量进行调整。
4.封闭使用封闭缓冲液（例如脱脂乳或牛血清白蛋白（BSA））处理膜，通常在室温条件下孵育1小时，以减少非特异性结合。
5.抗体孵育一抗反应：将膜浸泡在稀释的一抗溶液中，通常在4摄氏度的条件下孵育过夜，或在室温下孵育12小时。
二抗反应：洗膜后，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，孵育30分钟至1小时，然后再次洗膜。
6.检测采用化学发光法或显色法进行检测，化学发光法具有更高的灵敏度，通常使用HRP底物进行显色。
7.数据解析利用成像系统记录结果，并根据标准曲线或对照样本进行定量解析。
注意事项在进行血清或血浆的蛋白质印迹实验时，需留意一些关键事项。首先，要防止蛋白质降解，因为蛋白质降解会影响实验结果的准确性。在选择上样量时，需了解目标蛋白质在血浆或血清中的含量，以确保选择适当的上样量。
此外，在使用血清或血浆样本进行蛋白质印迹时，由于低丰度蛋白质的检出率较低，白蛋白可能会干扰电泳的分辨率和转膜效率。为提高低丰度蛋白质的检出率，可考虑使用去除白蛋白的试剂，这有助于减少干扰并提升实验结果的灵敏度。
另外，在选择内参蛋白质时，由于血浆或血清中难以找到稳定表达的蛋白质，常用的内参蛋白质如肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）等并不适用于血清或血浆。建议在血清样本的蛋白质印迹检测中使用转铁蛋白作为内参蛋白质，以确保实验的准确性和可靠性。在实验设计和操作中注意以上事项，有助于获得可靠且准确的实验结果。