技术软文|流式细胞仪电压调节概述

营养师

我们都知道流式细胞仪是非常重要的免疫学研究检测仪器，其检测的原理是在仪器的液流系统的作用下将流体样品内的细胞单个通过仪器的光学系统，由不同激发光源对细胞及其荧光进行激发，激发出的光信号通过滤光片分拣后进入对应的检测通道，最后由仪器的电子系统进行处理，通过光电倍增管（PMT）将光信号转换成电信号并进行放大成相应的电信号参数，由仪器软件计算处理后生成最终的流式检测图。在我们处理好流式检测样品上机时，第一步要做的是调节每个通道的电压，电压调节准确不仅会使待测细胞的荧光通道范围合理，而且会让多色荧光染色的补偿调节更简单。那么电压如何进行调节呢？
电压调节的作用？
      流式细胞仪中每个通道信号的强度可通过调节光电倍增管的电压来改变，这是因为荧光标记的细胞在穿过激光光路会产生电压脉冲，电压脉冲的大小也取决于PMT管的电压，通过增加PMT管的电压，可以制造更强的电流，从而产生放大增益和放大信号的效果，从PMT输出的电信号需要经过放大后才能输入仪器分析。流式细胞仪中一般备有两类放大模式，一类是线性放大，其输出信号与输入信号成线性关系，在检测细胞DNA、RNA含量，总蛋白含量时使用，因为这些指标细胞之间的差异变化不大，线性显示可以满足要求；另一类是对数放大，其输出信号和输入信号之间成对数关系，一般在检测细胞膜表面抗原时使用，由于细胞膜表面抗原的分布有时相差几十倍，甚至上万倍，如用线性放大，无法在一张图上清晰的将细胞阳性群和阴性群同时显示出来，因此通常选用对数放大测量。
如何进行电压调节？
      首先我们需要调节的是细胞物理图显示的电压，即FSC和SSC的电压，这个可以用空白管细胞进行调节，需要注意的是如果细胞进行了固定破膜处理，那么空白管也必须是固定破膜处理的细胞，因为细胞进过固定破膜处理后会缩水变小，和未处理细胞物理分布图不一样，一般情况下通过调节FSC和SSC电压，使细胞群体分布在坐标轴的中央部位，如果检测的目标细胞体积较小，可以适当提高电压值，使目标细胞与细胞碎片在流式图中能够完全分离；如果检测的目标细胞体积较大，可以适当降低电压值，使所有的目标细胞群完整显示于流式图中，防止细胞群接近于流式图的边界而变形扭曲或者完全处于边界外。
      其次我们需要调节每个荧光通道的电压，荧光通道电压调节最好用峰图显示，每个荧光的单染管都要进行上机调节，一般我们以阳性群细胞的峰值与仪器显示的最高对数值少一个数量级（例如仪器最高可以显示106，那么阳性群峰值在105左右）为准。阴性细胞群从0显示起峰，当然有时候需要考虑到荧光补偿的影响，我们会通过降低荧光通道的电压，来减少荧光的溢漏，这种情况会导致阴性细胞群体压边（部分阴性细胞在图上不显示）。
      最后我们需要将荧光补偿干扰的两两通道用散点图显示出来，在上机分析对应的单染管进行补偿调节，将所有通道补偿参数确定后，电压才能确认，如果有的补偿参数调节不好，需要通过平衡电压来优化（以下详述），优化电压后再来确定补偿。
电压和补偿的关联性？
      调节补偿时，一定要先调节好电压参数，才能调节补偿，补偿调节完成后，电压参数不能改变。由于在不同的电压条件下，荧光染料的激发效能也会不同，因此出现补偿调节异常时，需要降低每个PMT的电压，因为较大的电压会造成过多的荧光溢漏（图1）；



图1：通过降低电压来优化补偿

      此外如果两个荧光补偿通道之间的电压差过大，也可能导致补偿异常，这个时候需要平衡两个通道之间的电压来减少补偿（图2）。



图2：BV510和BV570荧光补偿的调节结果

电压没调节好就上样收集数据了，如何补救？
      如果FSC和SSC电压没调节好，是细胞无法分群，或者细胞压边没有显示，在 用flowjo软件分析数据时可以进行适当调整，例如以下情况，FSC和SSC电压过小，细胞无法分群，这个时候可以点击做标注的T按钮，选择customize Axis，通过降低坐标轴阈值(点击减号)使细胞群体放大，横纵坐标都调节好后可以圈门分析细胞，反之亦然。



图3：FSC和SSC阈值调整过程

      如果荧光通道的电压没有调节好，荧光图上显示的细胞可能压边，这个时候也可以通过上述方法进行调节。如图4，荧光信号压边，没有全部显示，这个时候我们可以点击荧光通道上的T按钮，选择customize Axis，通过放大坐标轴阈值(点击加号)使细胞群体都显示在坐标轴，横纵坐标都调节好后可以进行正常圈门分析细胞。



图4：荧光信号阈值调整过程

      由于以上补救方法在部分仪器收集的数据上不能使用，因此该方法仅供大家参考使用，最好还是正确调节好电压，使我们的检测结果准确。
      想了解更多技术知识，可联系小编获取流式手册，希望能帮助到老师们顺利完成实验，再次感谢大家对BioGems China的关注与支持。

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