实验干货分享！常见核酸提取与纯化原理

生物科研实验室

核酸分离与提纯是分子生物学、生物医学探究及临床检测等范畴中必不可少的基础实验环节。其旨在从样本（例如血液、组织、细胞、病毒等）中分离并提纯出高纯度的DNA或RNA，以便开展后续的PCR扩增、基因测序、分子杂交、芯片检测等多种实验。
实验操作原理01 裂解过程：样本首先通过物理和化学手段进行裂解，物理手段可能包含研磨、超声波破碎等，使细胞壁破裂，释放出细胞内的核酸。
化学试剂如十二烷基硫酸钠、苯酚/氯仿、异戊醇等用于瓦解细胞构造，溶解蛋白，并辅助分离核酸与蛋白、脂质等其他杂质。
02 去蛋白过程：加入蛋白酶K以消解蛋白，降低蛋白对核酸的污染。
运用苯酚/氯仿萃取或离心柱技术，依据相分离原理，将核酸转移至水相，而蛋白、多糖及其他有机物则主要存在于有机相。
03 沉淀与清洗过程：通常利用乙醇或异丙醇在适宜条件下使核酸沉淀。
沉淀后用高浓度乙醇进行多次清洗，以去除盐分及其他残留的小分子化合物。
04 干燥与溶解过程：将核酸沉淀充分干燥后，用无RNA酶/DNA酶的水或缓冲剂溶解。
对于RNA提取，还需添加RNA酶抑制剂以防止RNA酶降解RNA。
05 提纯过程：可采用离心柱技术结合硅胶膜吸附或磁珠技术，通过特定洗脱条件选择性地捕捉并洗脱核酸。
如需进一步提纯，可通过柱色谱、PAGE电泳切胶回收等方法提高纯度。
实验要点提示一、操作细节1）保证所有材料和仪器均为无菌且无核酸酶活性。2）所有操作需在冰浴中进行以延缓核酸降解。3）裂解液与样本充分混匀以确保完全裂解。4）萃取过程需严格控制时长、温度和离心力。5）RNA提纯时需注意防止DNA污染，可加入DNA酶处理。
二、注意事项1）根据样本类别调整裂解方法和裂解液配方。2）苯酚/氯仿萃取时需注意其毒性和挥发性，操作应在通风橱内执行。3）避免核酸反复冻融，以防其降解。4）核酸浓度和纯度测定：采用紫外分光光度计测定OD260/OD280比值评估纯度，OD260/OD230则可评估样本中有机污染物残留状况。5）存储核酸时应置于-20℃至-80℃低温冰箱，并尽快使用以保持最佳状态。