Western Blot中常见的问题及解决方案总结

奋斗的小鸟

【i实验】是i科研公众号推出的一档全新的专栏。在这个专栏里，我们将深入浅出地为您介绍经典实验的原理和操作方法，分享实验资料，解析实验技巧，为实验小白们提供入门的指南。
很多小伙伴在看了上期的Western Blot入门讲解后，也开始尝试Western Blot实验。不过即便是经验丰富的“老手”，依然会在实验中遇到很多问题。其实，实验中的每一个步骤中都存在诸多细节，对细节的把握和对原理的理解往往能帮助实验者取得更好的实验结果。
本期i实验将Western Blot中常见的问题及解决方案进行了总结，帮助各位小伙伴更好地完成Western Blot实验。


在上期推送中，我们简单地介绍了Western Blot的原理，想要了解的小伙伴请点击下方图片。在实际操作中，常见的问题主要分为三类：在SDS-PAGE过程中出现相关问题、结果的背景值问题以及结果的信号问题。下面让我们来一一解答这些问题。
WB常见问题


电泳过程中可能遇到的问题及原因
大多数实验室需要在实验开展前制备凝胶，而凝胶的质量关乎电泳的结果。很多“新手”在制备凝胶时会遇到“漏胶”的现象。及时查漏是解决“漏胶”的好办法。除了用这个办法解决漏胶的问题之外，↓视频中的小伙伴用了一个更实用的方法来避免这个问题。快点开看一看吧。


https://www.zhihu.com/video/1221565001607221248
配好胶后，就可以在设置好的参数下进行电泳了。不过，有时候电泳的结果并不尽如人意。小编将这些问题及原因进行了总结，供小伙伴们参考。


Western Blot产生过高背景值的原因抗体浓度太高
无论是一抗还是二抗，过高的抗体浓度都会引起实验结果背景值的偏高。因此，实验前需要优化一抗和二抗的稀释倍数。
❷ 非特异性位点封闭效果不佳
封闭（blocking）不充分会导致膜上存在过多的非特异性位点，这些非特异性位点会吸附抗体从而造成背景值升高。
❸ 洗膜不充分
洗膜不充分可能造成膜表面过高的HRP 浓度，从而引起背景值的升高。可以通过适当增加洗涤次数或延长洗涤时间来解决这个问题。
❹ 选择的膜容易产生高背景
硝酸纤维素膜（NC）的背景通常会比 PVDF 膜低，但是具体选择哪种膜还要综合实验需求而定。
❺ 膜被污染
操作时用手直接持膜或造成膜的损害都可能引起膜的非特异性吸附。切记实验过程中要始终带干净手套，并用镊子来对膜进行操作。
❻ 膜的曝光时间过久
❼ 交叉反应
封闭液中可能含有引起交叉反应的物质。可事先用对照实验对交叉反应进行检测。


Western Blot信号值较低的原因及解决方案


以上是小编本期为大家奉上的在Western Blot实验中可能遇到的一些问题和解决办法。下面的视频对Western Blot的原理和操作进行了讲解和演示（from Cell Signaling），进一步加深对大家对Western Blot实验的理解。


https://www.zhihu.com/video/1221565420773175296


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