流式细胞术的原理、应用及分析整理——检测细胞增殖

检验之星

上文中我们讲述了如何检测胞内细胞因子的方法，今天我们将讲解检测细胞增殖的方法
<hr/>细胞增殖的检测方法

3H（氚离子）掺入法

• 原理：是在细胞DNA合成时，用3H脱氧胸腺嘧啶核苷代替普通的脱氧胸腺嘧啶核苷掺入新合成的DNA中，增殖的细胞因为掺入3H而具有放射性，通过定量检测样品细胞的放射性大小而反映细胞的增值活性
  
• 缺点：1）使用的是具有放射性的同位素，操作较为复杂，同时需要采取放射性保护措施 2）低比例高活跃增殖和高比例低活跃增殖可能得到的是相同的结果，用此方法无法进行鉴别 3）此方法无法进一步得到具有活性的增值细胞用于下一步的研究 4） 此方法时间较短，无法检测加入前细胞的增殖情况，而且检测到放射性只能说明细胞DNA合成，而不能提供合成DNA的细胞是否进入增殖阶段的信息
  

流式细胞术检测细胞增殖

相对计数法

• 原理：将对照组和各实验组控制在相同条件下直接计数然后比较计数结果得到增殖结论
  
• 注意点：
  

对照组与实验组每种细胞所加浓度必须相同，每组至少设置3个复孔，这样每个孔可以得到1个细胞数，将3个复孔取平均值后就是这个组的结果。如果同时需要得到每孔目标细胞增殖后的绝对参数，在每孔细胞中加入1*105PE标记的人工微球作为内参
收集各组的细胞于EP管中，注意必须尽量将各组的所有细胞都收集起来。标记需要计数细胞的标志表型的荧光素偶联抗体，4℃静置30min
PBS洗涤一次，洗去游离的抗体
示踪染料标记法

• 示踪染料与细胞结合的方式：1）能够与细胞内的蛋白质上的氨基发生非特异性的共价结合 2）能够非特异性地嵌入细胞膜的脂质双分子层中与细胞发生非共价性结合
  
• 原理：示踪染料的荧光信号都很强，当细胞分裂时，母细胞内的染料会被平均分配到子细胞中，细胞荧光信号会被减弱一半，所以通过检测减弱的、发射示踪染料荧光信号的细胞比例就可以判断细胞增殖的强弱。当荧光强度减弱到标记时的1/2以及以下的细胞都是增殖后的细胞，这些细胞所占比例越高则代表细胞增殖越活跃
  
• 标记方法
  

纯化增殖反应的目标细胞，将细胞的浓度调整为1*106/ml，加入CFSE，其标记浓度为5微摩尔/升。置于37℃水浴中标记15min，在标记过程中每隔一段时间混匀细胞一次
加入预冷、含有血清的培养基终止标记，在4℃冰箱中静置5min，离心沉淀
用培养基再洗涤一次，尽量洗净未结合的游离的CFSE，然后将目标细胞静置在增殖体系中
BrdU和EdU掺入法

• BrdU：5-溴脱氧尿嘧啶核苷是胸腺嘧啶核苷的类似物，其特点是胸腺嘧啶环上5位C连接的甲基被溴取代，在细胞增殖DNA合成时可以与内源性的胸腺嘧啶核苷竞争掺入到新合成的DNA中，而BrdU抗体可以特异性的识别BrdU，不与胸腺嘧啶核苷结合，所以可以用于检测细胞增殖
  
• 适用范围：适用于体内检测目标细胞的增殖，一般将BrdU掺入小鼠的应用水中或经腹腔注射，经过一段时间后，取出目标细胞制成单细胞悬液然后用多聚甲醛固定细胞，后用打孔剂皂苷在细胞膜上打孔，最后标记荧光素偶联抗BrdU抗体，目标细胞的BrdU阳性细胞就是增殖的细胞，阳性比例越高，增殖越活跃。
  

其他方法

• 细胞周期法检测细胞增殖：流式细胞术能够检测细胞内DNA的含量，所以可以检测细胞周期。处于S期的细胞，DNA的量处于二倍体和四倍体之间;处于G2/M期时，DNA量为四倍体。处于S期和G2/M期的细胞比例越高说明细胞增殖越活跃
  
• PCNA检测细胞增殖：PCNA（增殖细胞核抗原），在细胞核合成且只存在于细胞核内，是DNA聚合酶的辅助蛋白，所以与细胞DNA的合成关系密切，是反映细胞增殖状态的良好指标
  
• Ki-67检测细胞增殖：是一种与细胞增殖特异相关的核抗原
  
• CD71检测细胞增殖：是转铁蛋白受体，表达于细胞的表面，该受体广泛表达于各种恶性肿瘤细胞表面，正常细胞表达较少，与肿瘤细胞的增殖密切相关
  

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