流式细胞术原理、应用及分析整理——（流式分析模式选择、上样速度）

风云

上文中我们讲解了阈值的设定和死细胞的分析，今天我们讲解流式分选模式选择和上样速度的控制。
<hr/>分选的原理

• 原理：先对细胞进行流式分析，判断该细胞是否为目标细胞，如果是目标细胞，则对该细胞施加一定电量的正或负电荷，目标细胞在强电场中发生偏转进入接收管中；如果不是目标细胞，则对该细胞不做处理，细胞不带电荷，在强电场中不发生偏转而直接进入液孔中。
  
• 存在的问题：流式分选并不是直接对细胞进行操作而是对细胞所在的液滴进行操作。理想的条件下，一个液滴中只有一个细胞，细胞处于液滴正中，所以对细胞进行操作和对液滴进行操作并无区别。在实际分选情况下，细胞在液体中的分布是不均匀的，细胞与液滴不能达到完全一对一的状况，当仪器对可见液进行打点时，有些液滴中可能没有细胞而有的液滴中存在不止一个细胞
  
• 液滴中没有细胞时——直接忽略，不对该液滴进行任何的加电荷操作
  
• 液滴中有存在不止一个细胞——如果分选该液滴，非目标细胞也会进入接收管中，从而影响分选纯度。不分选该液滴，目标细胞会进入废液桶影响分选的得率
  

分选模式

纯化模式（有一样的就要）

• 原理：只有当液滴中为目标细胞时才进行分选，无论液滴中只有1个细胞还是多于1个细胞，如果该液滴中有非目标细胞，不管该液滴中存在多少目标细胞也不进行分选。一般一步分选一种目标细胞时首选这种模式。
  
• 样品细胞的浓度：不应该太浓，否则细胞和液滴的比例会增加，平均分配给细胞的液滴数量会减少，多个细胞共存于一个液滴的概率增加，目标与非目标细胞共存于同一个液滴中的概率也会增加，会进一步降低目标细胞的得率。也不能够太稀，样品内细胞含量降低，样品体积会相应增加，分选所需要的时间会进一步增加，从而影响分选后所得细胞的活性。
  

富集模式（有就要）

• 原理：无论液滴中是否含有非目标细胞，也不管液滴中非目标细胞的比例有多高，只要液滴中存在目标细胞就分选该液滴。富集模式注重的是细胞的得率
  
• 样品的浓度：当希望保证目标细胞的得率的同时保证目标细胞的纯度，则可适当地降低样品细胞的浓度，减少目标细胞与非目标细胞的共存的概率
  
• 应用范围：一般用于二步法分选比较低比例的细胞，当目标细胞的比例低于样品细胞的1%时，直接用纯化模式得到的细胞纯度较低，此时可先用富集模式富集目标细胞，然后再用纯化模式分选。
  

单细胞模式（有单个一样的才要）

• 原理：只有液滴中有且只有一个细胞，且该细胞是目标细胞时，才分选该液滴。如果液滴中不止一个细胞，即使液滴中存在目标细胞也不进行分选
  
• 优点：单细胞模式能够精确的计数分选后得到的细胞，当实验要求准确计数分选得到的细胞时，就应该使用单细胞模式
  

上样速度的控制

上样原理

• 原理：流式细胞仪的液流系统主要有样品流和鞘液流两个子系统组成，鞘流液位于外围而样品流位于中央，分别由两个压力所控制。二者流速是相同的，改变样品压的大小只是改变样品流的直径。增加样品压，位于中央的样品流的直径就会增大，单位时间内通过的液体量就会增加。
  

流式分析的速度控制

• 低速上样，样品流的直径最小，样品流内细胞位于正中的概率最大，所得到的数据是最接近细胞的真实数据；
  
• 高速上样，样品压相对较大，样品流的直径最大，样品流内细胞偏离样品流正中的概率最大，分析数据偏离真实数据的概率最大；
  
• 当分析的样品较多，目标细胞比例较低，就可以选择中速或高速分析。当待分析的样品较少，时间不是主要考虑因素时，就选择低速分析。
  

分选模式	分选速度控制	目的
纯化模式	不超过理论最高分选速度的50%	保证分选得率
富集模式	不超过理论最高分选速度的80%	保证分选纯度
单细胞模式	不超过理论最高分选速度的30%	保证分选得率和纯度

<hr/>今天我们介绍了分选模式的选择、上样速度的控制两个问题，接下来我们将讲解分选设门的基本原则。

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