流式细胞术中的对照设置，这一篇就够了！

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阴性对照的设置
不仅荧光素能够在激光的激发下产生荧光，细胞表面的某些分子或者结构也能够产生荧光，这种荧光相对于荧光素产生的荧光较弱，而且与细胞表面的特异抗原分子没有相关性，被称为非特异性荧光。所以，在特定的激光激发下，细胞产生的荧光并不是绝对的有和无，细胞表面不结合流式荧光素时也会产生荧光信号。每一种细胞都会产生非特异性荧光，流式检测时得到的荧光信号是细胞本身的非特异性荧光和来自于细胞表面结合的荧光素的特异性荧光叠加得到的结果。所以分析流式结果时，不能因为得到了荧光信号就判断细胞表面肯定结合有相应的荧光素，从而判断细胞表达相应的抗原分子，而应该比较该荧光信号与细胞的非特异性荧光，如果得到的荧光信号大于非特异性荧光，说明得到的荧光信号部分来源于荧光素的特异性荧光，就可以判断细胞表达相应的抗原分子。所以，确定与荧光素无关的细胞自身的非特异性荧光的强弱非常重要，此时就需要设立阴性对照。图中是3类阴性对照和标记荧光素偶联抗体(抗CD69-PE)得到的荧光信号的示意图。相比于前面3类阴性对照，可以得出这群样品细胞中有30％的细胞表达有CD69抗原分子。如果没有阴性对照作为参照，直接根据最后标记荧光素偶联抗体组的荧光信号无法判断样品细胞中有多少比例的细胞表面结合有PE荧光素，从而也就无法判断有多少比例的细胞表达CD69抗原分子。


这3类阴性对照是比较全面的阴性对照：第1类“negative”表示的是不加任何荧光素偶联抗体时得到的荧光信号，因为没有标记任何荧光素，所以这组得到的荧光信号与荧光素无关，与细胞抗原分子是否表达无关，得到的荧光信号代表的是非特异性荧光信号；第2类“抗CD69”表示的是用抗CD69抗体标记样品细胞后得到的荧光信号，虽然抗CD69抗体能够与细胞表面的CD69抗原分子结合，但是抗CD69抗体没有偶联荧光素，所以得到的荧光信号也与细胞表面是否表达有CD69分子无关，得到的荧光信号代表的也只是细胞本身的非特异性荧光，所以这种对照用于排除抗体的影响；第3类“IgG1-PE”表示的是标记与抗CD69抗体同种属（来源于同一物种）且同类（抗CD69-PE中的抗体是IgG1类的）的非特异性抗体（IgG1）与PE荧光素偶联的同型（isotype）对照抗体（IgG1-PE）后，得到的荧光信号，这种同型对照抗体不能与细胞表面的CD69发生特异性结合，所以细胞表面不会结合有IgG1-PE，最后得到的荧光信号不是PE荧光素产生的特异性荧光信号，而是代表细胞本身的非特异性荧光，所以这种对照用于排除荧光素的影响。阴性对照的设置是流式细胞术中非常重要的一个步骤，每次流式分析时都必须设置阴性对照。设置阴性对照不需要如图所示的3种阴性对照全部设置齐全，一般只需要设置1种阴性对照就可以了。第1种阴性对照是最简单也是最为常用的对照，每次流式分析时多准备一份样品细胞，不标记任何荧光素偶联抗体，在流式上样时先检测这份样品细胞，设定各个通道的电压，再根据其非特异性荧光信号值标记阴阳性分界线，然后再检测标记有各种荧光素偶联抗体的样品细胞，荧光信号值在阴阳性分界线以上的细胞为阳性细胞。当实验要求不高、已进行预实验或者能够确定同型对照的荧光信号与不加同型对照的这种阴性对照结果一致时，就可以采用这种阴性对照的设置。第2种阴性对照设置方法只是一种理论上的设置方法，是为了便于理解阴性对照的设置原理才列于此处，一般流式分析时不会应用到这种阴性对照。第3种阴性对照的设置方法，称为同型对照设置，是常规的阴性对照设置法，正式的流式图的数据都必须建立在这种同型对照的基础之上，在同型对照基础上得出的流式结果是最可靠的。细胞的非特异性荧光的强弱由细胞本身所决定，与细胞的体积大小有关，一般细胞体积越大，其非特异性荧光就越强；体积越小，其非特异性荧光就越弱。如实体脏器细胞或者肿瘤细胞比免疫细胞的非特异性荧光要强：同是免疫细胞，体积较大的巨噬细胞的非特异性荧光要强于体积较小的淋巴细胞；而细胞体积相同的T细胞与B细胞，它们的非特异性荧光强度相差不多。所以，分析每一种样品细胞时，都需要设定这种样品细胞的阴性对照，不能用一种细胞的阴性对照值分析另外一种细胞，尤其是在体积相差较大时更不能互相借用阴性对照值，如不能将肿瘤细胞的阴性对照结果用于分析免疫细胞。FMO对照

减一阴性对照（fluorescence-minus-onecontrol，FMO对照）是一种特殊的阴性对照，是指在多色（通道）分析时对其中某一个通道特别设置的阴性对照，多在研究不同细胞亚群表达某些重要的表型分子、细胞因子等时应用。如需要研究人PBMC中CD62L+CD4+和CD62L-CD4+两个细胞亚群表达CD45RA这个重要表型分子的表达情况时，需要同时标记不同荧光素偶联的抗人CD4、CD62L和CD45RA抗体，除了常规的阴性对照设置，最好再设置一组FMO对照，就是只标记荧光素偶联抗人CD4和CD62L抗体，而不标记荧光素偶联的抗人CD45RA抗体，然后将CD62L+CD4+和CD62L-CD4+细胞亚群分别设门，将两群细胞分别显示于新的散点图中，散点图上其中一个轴代表CD45RA的荧光信号，这时就可以分别设置这两个细胞亚群CD45RA通道的阴阳性界线，然后再上样分析实验组，根据不同细胞亚群各自的阴阳性界线分别判定细胞亚群各自表达CD45RA的情况。这种特殊的阴性对照就是FMO对照。因为不同细胞亚群的非特异性荧光可能存在差异，而且不同细胞亚群结合有不同的荧光素偶联抗体从而使它们的最佳补偿值存在差异，当在统一的补偿条件下同时分析时，不同细胞亚群在某一通道的阴阳性界线就可能存在差异，普通阴性对照无法进一步区分这种差异，而FMO对照就可以通过只缺少标记这一通道代表的荧光素偶联抗体，精确界定不同细胞亚群各自的这一通道的阴阳性界线，从而使流式分析结果更加精确。
阳性对照的设置

设置阳性对照，就是在使用某种荧光素偶联抗体前先采用一定的方法检测该荧光素偶联抗体是否有效。阳性对照并不是毎次进行流式分析时都必须设置，一般在遇到以下情况时设置:（1）使用新的荧光素偶联抗体时，该荧光素偶联抗体以前没有使用过（2）换用不同公司的或者同一公司但不同批号的荧光素偶联抗体时。（3）使用储存时间较长的荧光素偶联抗体时。以上三种情况都可能会因为各种原因如生产、运输或者保存不当等导致荧光素偶联抗体失效，从而无法正常标记样品细胞，此时即使细胞表达有相应的抗原分子，这种失效的荧光素偶联抗体也有可能无法与抗原分子结合产生特异性的荧光信号，得到假阴性的结果。设置阳性对照，检测荧光素偶联抗体是否有效，一般有两种方法：①肯定表达有相应抗原分子的样品细胞来检测，如检测荧光素（不管哪种荧光素）偶联的抗小鼠CD4抗体，可以用该抗体标记正常小鼠的脾脏细胞，因为该细胞内肯定有CD4阳性细胞，而且已知CD4阳性细胞占脾脏细胞的大致比例范围，所以如果用该抗体标记脾脏细胞得到意料中的结果时，就可以认为该抗体有效；②如果实验室有已证明有效地与待测荧光素偶联抗体的单克隆抗体相同但偶联的荧光素不同的荧光素偶联抗体，如需检测FITC偶联的抗小鼠CD4抗体（FITC-CD4抗体）是否有效，实验室已有证明有效的PE偶联的抗小鼠CD4抗体（PE-CD4抗体），这时可以用这两种荧光素偶联抗体同时标记同一份肯定表达有相抗原分子（CD4分子）的样品细胞，流式检测后如果PE阳性的细胞FITC也是阳性的，PE阴性的细胞FITC也是阴性的，就可以证明该待测的荧光素偶联抗体有效。

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