免疫诊断技术，何去何从？

千姿百态

体外诊断(IVD)领域是医疗检测领域中重要的一环，根据《中国医疗器械蓝皮书(2021)》统计数据显示，我国体外诊断市场规模已达890亿元，年均复合增长率达20.39%，预计2022年将达1290亿元的市场规模。受人口老龄化、慢性疾病发病率上升、临床实验室加强、家庭护理测试设备的兴起等因素，IVD领域保持着极为迅猛的增长趋势。据中研普华产业研究院出版的《2023-2028年中国体外诊断(IVD)行业竞争格局分析及发展趋势预测报告》统计分析显示，预计2030年中国IVD市场规模将增长至人民币2881.5亿元，表现出极大的潜力。免疫诊断技术是IVD领域中最大的细分市场，占IVD市场额的30%以上。其中，以罗氏(28%)、雅培(15%)、西门子(6%)、贝克曼(7%)为首的第一梯队占据国内免疫诊断市场份额的50%以上(2021年数据)。从国内企业来看，迈瑞、新产业、安图等企业后来居上，逐渐实现国产替代。在市场反馈过程中，我们也能清晰地认识到，国产免疫诊断仪器和试剂与竞品之间的差异，主要集中在项目菜单完整性、测试速度(通量)、准确性(阴阳符合率)、灵敏度、线性、抗干扰性、自动化程度、智慧实验室、AI辅助等诸多维度和方面。在同质化异常严重的IVD领域，如何破局？如何实现跟跑、并跑到领跑的转变？唯有依赖技术革新！纵观免疫诊断技术在中国发展的60多年，免疫诊断技术经历了以放射检验免疫(RIA)、酶联免疫技术(ELISA)、免疫层析、化学发光免疫检验(CLIA)等技术迭代，每一次技术革新都显著改变了IVD的市场格局。本报告将结合免疫诊断技术发展和变化的趋势，解读免疫诊断领域未来技术方向。
       自20世纪60年代以来，免疫诊断技术逐渐引入国内。免疫诊断技术的核心在于抗原抗体反应，高选择性的抗体特异性地识别靶标抗原，实现抗原的检测。免疫诊断试剂基本上由三组分组成，包含基底、捕获抗体、标记抗体，其原理路线基本如下图1所示：


       捕获抗体通过化学修饰或物理方法固定在基底表面，标记抗体上标记有可读取的标志物。当进行检测时，基底上的捕获抗体会高选择性、高灵敏度地结合抗原(第一结合位点)，形成捕获抗体-抗原复合物。进一步，捕获抗体-抗原复合物与标记抗体结合，形成捕获抗体-抗原-标记抗体复合物(夹心复合物)，通过洗去多余的游离的标记抗体组分，读取形成夹心复合物中标记物的信号，它等效于血液样本中抗原的浓度，最终实现抗原的检测。
       免疫诊断技术经历了以放射检验免疫(RIA)、酶联免疫技术(ELISA)、免疫层析、化学发光免疫检验(CLIA)等技术迭代，每一次技术变革，都离不开以下三点：1. 基底优化。从ELISA技术中的二维平面材料替换成了可快速分离的一维微纳米磁珠材料；2. 标记端信号源优化。从危害性大的放射性同位素更换为荧光材料(免疫荧光)、纳米金(胶体金层析)等；后更新为具备信号放大功能的酶材料(碱性磷酸酶体系ALP/辣根过氧化氢酶体系化学发光HRP)、化学发光标记物(吖啶酯等)、电化学发光标记物(三联吡啶钌体系)，进一步提高免疫检测的反应速率和检测灵敏度；3. 抗体迭代。由多克隆抗体替换为选择性更优、灵敏度更高的单克隆抗体，进一步提高试剂的特异性和灵敏度。
       酶标抗体是指在标记抗体上修饰特定标记物的技术。该标记物可以是电化学响应的：如二茂铁。但受电化学信号的稳定性差、信噪比低的影响，电化学免疫检测技术的灵敏度、准确度、精密度较光学响应体系低。目前市场上仅有雅培的I-stat系列能够实现心梗指标如cTnI等的电化学测定，且具有不错的市场反馈。光学响应的标记物包括吖啶酯、碱性磷酸酶、辣根过氧化氢酶和三联吡啶钌体系。光学响应的标记物是目前市面的主流：吖啶酯具有响应时间快的优势，其在2s内技能实现快速的信号响应，而同等体系下，碱性磷酸酶和辣根过氧化氢酶则需要更长的时间(≈60s)才能获得较大的信号响应；在批间一致性上，以吖啶酯为代表的化学品具有更优的一致性，尽管现有的碱性磷酸酶批间一致性已经达到了相当优异的水平。从影响抗体效价结果来分析，小分子的吖啶酯体系对抗体结合位点的影响较小，而碱性磷酸酶和辣根过氧化氢酶的体积效应可能会降低抗体的效价。然而，由于碱性磷酸酶体系的研究更为深入，其相关工艺一致性、稳定性的研究更为透彻，当前以碱性磷酸酶体系作为标记物的企业不在少数。三联吡啶钌体系是罗氏诊断的专利技术，其响应速度快，批间一致性优，被认为是下一代标志物的代表之一。
      结合当前的市场表现来看，对标记物提出了更高的要求，主要集中在以下五点：
       1．提高测试通量和降低急诊检验周转时间（TAT）。这要求所修饰的标记物具有更快的响应速度。酶作为标记物的碱性磷酸酶和辣根过氧化氢酶体系受限于较长的酶与底物的反应时间，反应时间很难进一步压缩，因此，以吖啶酯和三联吡啶钌标记物体系将成为重要的发展趋势。此外，以科美诊断为主要代表的企业引用了光激发光体系，利用光激发光的距离效应（取决于O2自由基的失活距离），巧妙地回避了当前化学发光需要的清洗步骤，该操作可以有效缩短清洗时序约1-2min的时间。另有一些企业通过FRET（Forster能量共振转移效应）实现了免清洗的目的，其作用机制与光激发光类似，利用了FRET过程中的距离效应（10-100nm）。但以上体系同样存在一定的局限，如在全血测试方面的抗干扰能力或弱于其它反应体系。
       2．极致的信噪比。针对一些血液内含量更低的标志物，如阿尔兹海默症标志物AβO和Tau蛋白。在阿尔兹海默症的早期，AβO和Tau蛋白＜fg/mL的级别，远超现有免疫检测技术的极限(尽管现在化学发光的检测限能够达标pg/mL如超敏cTnI，但其精密度和阴阳符合率不尽人意)。超高信噪比的标记物会成为此类项目检测的主流，典型的如荧光标记物、量子点等。此外，超高信噪比同样依赖极致的清洗能力。目前关于信号放大的途径较多，主要集中在表面等离激元共振增强荧光，PCR放大模型（滚环扩增等），酶促放大模型，单分子检测技术（SiMoA）等。另外，抗体定向标记技术也是提高信噪比的一种手段，其主要通过利用酶将抗体中特异性识别抗原的位点切割下来，进一步提高抗体的修饰效率和提高抗体的亲和力。
       3．抗干扰能力。针对ALP和HRP体系，需要注意由标记物引起的非特异性吸附。相比较于吖啶酯等小分子，酶分子的蛋白结构更容易吸附血液中的蛋白、短肽、氨基酸或油脂等，或者造成夹心复合物的桥接，造成假阴或者假阳的错误结果。针对这一点，未来的标记物应当能够具备超强的抗干扰能力，避免由标记物分子引起的非特异性吸附。此外，抗体定向标记技术同样能够提高体系的抗干扰能力，通过去除抗体的非结合位点，可以有效降低源自非结合位点的非特异性干扰。
       4．稳定性。良好的标记物应当能够兼容更宽泛的温度环境，pH梯度等。此外，能够经受存储稳定性、运输稳定性等苛刻的条件。现有的化学发光试剂盒存储效期大多为1年左右，主要受限于试剂的稳定性方面。一旦解决试剂稳定性的问题，通过提供更大包装，更多人份数的试剂盒能够更进一步减小单人份的试剂成本。
       5．可修饰性。免疫检测技术的核心依赖于抗体-抗原-抗体夹心复合物的形成。新型标记物应当能够轻易的修饰在第二抗体上，意味着标记物应当具有可修饰的官能团，如羧基、氨基、马来酰亚胺、巯基、醛基等易于修饰的官能团。此外，针对批间一致性的考量，标记物应当具有定向标记的能力，具有明确的结合比等信息。
       免疫诊断技术作为当前IVD检测的主流技术，受到了各大公司和企业的青睐。然而，IVD检测赛道同质化异常严重，市场竞争巨大，回顾市场发展历史，我们不难发现，每一次IVD市场格局的变革都与技术革新密切相关，掌握免疫诊断新技术和方向，才能更好的在市场破局。

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/15851000517