质谱定量（二-杂质定量）

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“ 前一篇文献整理-质谱定量（一）介绍了质谱定量的方法，本期继续介绍主要的应用，包括产品相关变体及工艺相关杂质（如HCP）的表征定量”

今天这一期主要介绍HCP监测的必要性，常规方法以及质谱法的应用等，如果有工作涉及到HCP内容的小伙伴，可以看一看。

01产品相关变体表征

在生物制药的生产和制造中，确保各种组分的正确和一致的组装对于保持双特异性和多特异性抗体以及ADC的关键质量属性至关重要。组成完整性通常可以通过完整或亚基LC-MS分析来定量测量。例如，Jiang等人描述了混合模式尺寸排阻色谱法中使用完整和还原LC-MS来表征来自双特异性抗体的不同形式的抗体。为了快速评估ADC的完整性，Firth等人开发了一种快速亚基LC-MS方法，以计算去糖基化、IdeS消化和还原步骤后的药物-抗体比（DAR）。与基于抗体的生物制剂相比，病毒结构蛋白丰度或其比例的量化对于评估基于病毒载体的疫苗或基因治疗产品的效价、感染性等具有重要意义。例如，历史上疫苗是使用需要对数十只动物进行免疫的体内效价测定来表征的。当代疫苗依赖于多种分析工具，包括PCR、蛋白质印迹或免疫化学等半定量测定，以有效证明病毒载体疫苗的转基因表达并评估其效力。免疫测定通常使用源自动物血清的抗体，其生产过程可能需要大量资源且耗时。为了最大限度地减少对动物试验的依赖，疫苗效价试验可以极大地受益于使用无动物和抗体的分析工具，如定量MS。利用LC-MS的无试剂方法对于大流行的准备特别有价值，因为它提供了一个关键的无试剂解决方案。除了生物制药产品表征外，定量MS还广泛应用于产品相关变体的表征，包括分析不同模式的序列变体和蛋白质修饰。生物制药产品在其加工、制造和储存阶段可能经历过多的天然存在或化学诱导的蛋白质修饰。这些PQA包括各种蛋白质修饰，如糖化（+162 Da）、氧化（+16 Da）、脱酰胺（+1 Da）、末端变体和糖基化，这些变体我们之前基本都有介绍O糖基化修饰多维度分析，N糖基化修饰多维度分析，蛋白中比较常见的修饰-硫酸化？or 磷酸化?，C末端修饰-从酰胺化说起。定量MS方法的使用，包括完整或亚基LC-MS以及肽图谱方法，对产品相关变体的表征及其纳入监管申报是非常必要的。

02工艺相关杂质表征

2.1HCP监测的必要性（免疫原性和稳定性影响）
在工艺开发阶段，密切监测工艺相关杂质（如HCP和其他工艺杂质）至关重要，因为它们是可能影响产品质量的潜在关键PQA 。HCP来源于各种生物药品生产中使用的微生物，可能对生物制品的有效性和患者安全性产生不利影响。HCP可能对生物制药产品和辅料产生有害影响，包括免疫原性、生物活性和酶活性的改变。例如，在临床试验中，通过检测抗PLBL 2抗体，发现其中一种研究最充分的HCP磷脂酶B样2（PLBL 2）具有剂量依赖性免疫原性应答。但没有发现安全性事件和抗PLBL 2抗体之间的相关性。此外，也未观察到对抗药物抗体发生率的影响，这提示PLBL2缺乏佐剂作用。除免疫原性风险外，残留HCP还可能由于它们的直接生物活性导致严重的不良反应，如中国仓鼠卵巢（CHO）单核细胞化学引诱剂蛋白-1（MCP-1）、大肠杆菌中的 HCP鞭毛蛋白。最后，随着产率和制剂浓度增加，原料药和制剂的稳定性辅料已受到HCP的影响。这可能会导致对产品有效期的影响。例如，我们确定了第一个与mAb蛋白相关的残留HCP氨基己糖苷酶B（HEXB）与加速和强制降解稳定性条件下的N-聚糖降解有关。此外，mAb类药物原液在稳定性研究期间会被几种组织蛋白酶降解。另外，一组具有脂肪酶或酯酶活性蛋白酶与聚山梨醇酯(PS)80或20降解有关。除了HCP，其他通常用于生物处理的工艺杂质，例如血清白蛋白，苯肼酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂和低分子量工艺相关杂质也被视为潜在风险，在产品开发过程中需要仔细考虑。这些杂质通常存在于复杂的生物制药中，例如病毒疫苗和基因治疗产品。
2.2HCP检测方法及评价
为了满足监管指南并确保产品质量和安全，监管机构要求对工艺相关杂质进行检测和控制。许多传统的方法已被用于表征HCP，如总蛋白测定（例如，BCA和Bradford测定）、SDS-PAGE或包括ELISA在内的免疫测定。在工艺开发过程中，ELISA一直是用于总HCP的监管提交和高通量检测的主要方法。ELISA通过与标准品比较，提供了表达为免疫等效毫微克/毫克原料药的总杂质水平的简单免疫学测量方法。虽然ELISA具有高灵敏度、高通量、易于使用和在生产环境中易实施等优点，但该方法也存在公认的局限性。这些局限性包括缺乏特异性、抗原覆盖率不足和非线性稀释，这些在该领域已得到公认。
最近在SARS-CoV-2重组蛋白疫苗的研发中观察到这一局限性的一个例子，研究发现用于检测SARS-CoV-2 preS蛋白的多克隆抗体试剂也可识别糖基化HCPs。这导致严重地高估了(大约4 - 6倍)preS蛋白浓度。因此，使用的抗原剂量低于计划，制剂中含有高于预期水平的hcp，导致免疫应答低于预期，尤其是在老年人群中，并且接种两剂后的反应原性较高。此外，总hcp的ELISA检测不能提供关于单个hcp的鉴定和数量的信息，而这些信息对于生物制药生产过程的开发和风险评估至关重要。基于LC-MS的蛋白质组学方法提供的单个HCP信息可确保产品质量和安全，便于工艺优化，可进行风险评估和缓解，确保法规合规，并支持工艺变化期间的可比性研究。我们经常观察到，使用LC-MS对单个HCP的定量可能超过通过ELISA测定的总HCP。
2.3HCP质谱检测方法的挑战及解决
2.3.1HCP质谱检测方法中低丰度问题及解决
与原料药相比，由于低丰度HCP的浓度范围很宽，LC-MS对HCP的鉴定面临着巨大的障碍，特别是在基于单抗的生物制剂中。现代MS仪器通常具有4-5个数量级的动态范围。值得注意的是，据报道，某些高危HCPs，包括已知会降解制剂中的聚山梨醇酯赋形剂的脂肪酶或酯酶，据报道其在液体制剂中的生物制剂的保质期内，含量低于百万分之一(ppm)仍具有活性。已报道了各种方法来解决样品制备中与低丰度hcp相关的动态浓度范围的问题，以提高其鉴定，例如非变性酶解、蛋白质组学、使用蛋白A消耗药物物质、抗hcp亲和层析、分子量过滤、亲水性相互作用液相色谱(HILIC)富集，以及利用基于活性的蛋白质图谱富集的化学探针。除了样品制备外，我们还对LC和MS方法进行了优化，以促进低丰度HCPs的鉴定和定量。纳升液相、更长一维液相或二维液相等技术已被证明可以在液相分离过程中增强对低丰度HCPs的检测。此外，利用离子迁移率的气相分离技术(如高场非对称波形离子迁移率光谱法以及各种质谱采集方法(如BoxCar和DIA)已被有效地用于增强HCPs的识别。
2.3.2HCP质谱检测方法---相对定量
除了鉴定个体HCP外，非靶向蛋白质组学还提供了HCP相对定量的方法。已经提出了无标记LC-MS/MS定量方法，其中所有鉴定的蛋白质均被用于估计丰度，从而能够在不需要特定标记技术的情况下定量分析HCP。使用无标记方法的绝对定量可通过比较HCP丰度与原料药（如mAb产品的重链或轻链或加标重组蛋白）的丰度来实现。这种无标记的定量方法对于在各个纯化步骤中跟踪HCP特别有价值，能够彻底监测杂质清除并证明生产一致性和耐用性。由于MS中HCP之间电离效率的潜在差异，通过无标记蛋白质组学研究获得每种HCP（特别是低丰度HCP）的准确绝对定量可能具有挑战性。
2.3.3HCP质谱检测方法---绝对定量
为了实现准确的绝对定量，同位素稀释质谱仍然是蛋白质定量的金标准，这种分析技术是在添加了富集同位素的样品或同位素标记的分析物后，基于元素或化合物的天然同位素组成的改变进行分析，类似一种内标法。绝对定量可通过MRM或PRM和高分辨率MS实现。同位素稀释MS方法已被用于定量一些有问题的hcp。例如，Gao等人介绍了一种多重LC-MRM检测法，该检测法可同时监测已知会影响生物制品质量或患者安全的两种高危脂肪酶(PLBL2和LPLA2[溶酶体磷脂酶A2])。该方法在1-500 ng/mg的动态范围内呈线性，并与单一HCP的ELISA检测显示非常好的相关性。LC-MRM方法也被用于定量另一种与N -糖降解相关的HCP HEXB。这种有针对性的绝对量化方法为工艺支持提供了一种快速、准确的监测高风险HCP清除的手段，可以积极指导工艺改进和优化。除了与工艺相关的蛋白质杂质，靶向绝对定量也被用于监测工艺开发中与工艺相关的低分子量杂质。例如，Jiang等开发并验证了一种用于定量蛋白酶抑制剂Pepstatin A的LC-MRM-MS方法，以监测其在基于重组蛋白的疫苗下游过程中的稳健清除。该方法目前被应用于常规工艺开发实验和现场间可比性研究。除了同位素标记的绝对定量，库仑质谱的无标准绝对定量最近被用于在含有高度丰度mAb的情况下测量500 ppm的PLBL2。
2.4HCP质谱检测方法局限性
尽管LC-MS方法相对于ELISA具有很大的优势，HCP的鉴定和测量，关于方法通量、再现性和耐用性的原因，迄今为止限制了LC-MS平台作为HCP表征的主要方法的采用。高通量蛋白质组学的最新进展提高了样品检测速度和重现性。除了考虑通量之外，适当优化的基于LC-MS的蛋白质组学工作流程通常具有优异的再现性。例如，Husson等人评价了3种不同的HCP定量方法，这些方法显示出等效和良好的精密度，三次重复测定之间的绝大多数CV（变异系数）值低于5%。整个LC-MS工作流程的重现性和稳健性可以从样品制备、LC-MS和数据分析的标准化程序中大大提高。

03USP 质谱法定量HCP

除了这篇文献中讲到的，2023年5月，USP公布了<1132.1> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals by Mass Spectrometry，通则主要从样品制备、质谱测试条件的建立、数据的分析、质谱方法验证等多个方面介绍了质谱法在HCP残留中的应用及优势。本篇暂不详述，有兴趣的小伙伴可以先详读该通则，后期我们可能会进行分享。

参考文献：

https://doi.org/10.1016/j.jpba.2023.115581

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/15959419882