科研小白|实验入门第四讲——PCR技术

病理医师

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同学们，今天科研小白要给大家说说在实验中经常用到的一种分子生物学技术PCR技术。


一、PCR是什么




聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA（或RNA）片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。
PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。




二、PCR原理




基本反应原理
从专业的角度来说，PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：


1模板 DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 94℃ 左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；
2模板 DNA 与引物的退火 （复性）：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55℃ 左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；
3引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在 Taq 酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。
重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的「半保留复制链」，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4 分钟， 2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。


三、PCR的基本反应步骤








1.引物的设计：


引物需要自己查找文献或者自己设计，然后交给合适的生物公司来帮我们合成，合成引物，每管装1OD。拿到引物后需要加水溶解，但是因为引物是看不见的，所以为了防止溶解过程中引物的丢失，拿到引物后最好先高速离心（10000rpm, 4°C离心2min）再进行加水溶解（ddH2O）。水的体积按引物浓度稀释100倍，溶解好的引物用小管分装，每管装50μl即可，分装后放-20°C保存。
2.制作模板：


模板的制作可以直接借助试剂盒，一般情况下Trizol的试剂可以完全满足需要，直接按照试剂盒提示来做就可以了。


3.建立体系、上机：


PCR需要用到的DNA聚合酶、buffer、dNTPs。而经常用的DNA聚合酶有Taq酶，买的同时会附送10×buffer(主要成分是KCl、Tris-HCl和MgCl2，有些还有(NH4)2SO4)。做PCR之前要提醒大家一点，不是所有的PCR都用同样的反应体系的，也就是说PCR体系里用到的试剂除了10×Taq Buffer以外，其它其实都是需要摸条件的，但是按大多数情况来说，需要调整的并不多，可能需要调整的主要试剂是MgCl2（其实是要调整Mg2+的浓度）；可能需要控制的条件主要是退火温度，我在实验中用到的体系如下：


▲总体系为20μL:
▼循环体系如图所示：


4.跑胶验证：


在电泳之前，需要进行凝胶的配制，凝胶液配制的过程并不复杂，先用天平称取适量的琼脂糖粉末，加入到一定体积的1×TAE（Tris、乙酸、EDTA）缓冲液中，微波炉加热至沸腾，拿出来摇匀，帮助粉末溶解，反复沸腾多次直到粉末完全溶解。待溶液不烫手，将核酸染料加入溶液中摇匀，接着将溶液趁热倒到做胶的凝胶板上，插上梳子（用来预留加样孔），等半小时左右胶凝固拔下梳子，连胶带板一起放到电泳槽中，加电泳液至完全淹没整块凝胶（电泳槽中的电泳液也用1×TAE缓冲液）。然后将loading buffer与样品混合，加入到凝胶小空（“梳子”形成的洞）中，DNA maker作为对照，同样加入到筛孔中，然后插上电源开始跑胶就可以了，凝胶上有颜色的有两条带，等到前面的蓝色带跑到整块胶的2/3处停止电泳（断电），然后把胶拿出来，放到紫外光下观察条带。


四、常见的实验设计问题




1、如何查找引物？▲▲▲




引物设计/查找非常关键，引物的好坏很大程度上决定了PCR实验的成功与否，引物的序列可以从文献中查找，找到序列以后，还是要用软件（如Primer软件）比对一下，碱基是不是每个都正确。


2、退火温度如何设置？
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通常情况下，可以尝试用两条引物中较低的Tm值减去5℃来作为退火温度，但是这种方法有时候会不适用，在不适用的情况下可以考虑做12个退火温度，这样试下去，总会找到合适的退火温度。
3、如何确定我设置的PCR的体系是正确的呢?
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做PCR的时候需要同时做个内参基因(如b-actin），因为内参基因是肯定会表达的，如果内参能做出来，证明PCR体系是没有问题的，以此来做个质控。
4、凝胶制作时需要注意些什么？
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凝胶中一个需要注意的问题就是琼脂糖的浓度，这部分参数是根据目的片段的大小选择的，一般500bp以下选择1.2%-1.5%（质量体积比）500bp-10kb可以选择0.8%-1%，分子量再高的话琼脂糖浓度就再低点，具体浓度可以摸一下条件。




五、实际的实验过程中需要注意的问题



1、如何确定引物的浓度？

前面我们说到，引物一般交由试剂公司合成，有时候具体的浓度我们也不能确定。有些人喜欢稀释十倍，有些人喜欢稀释二十倍。我个人认为比较稳妥的做法是在每次拿到反转的 cDNA 后，先会稀释 3 倍左右，然后利用管家基因做一次 RT-PCR，循环数一般为 25 循环，鉴定一下具体浓度，再决定最后的稀释倍数。

2、合成的引物是我们想要的引物吗？


一般来说在拿到很多引物的时候，可以通过普通的 PCR 看看是否是单一条带，鉴定一下引物的特异性。如果实验室不差钱，则可以通过溶解曲线对所有的引物的特异性做一次鉴定。



3、操作过程中需要注意哪些问题？
一定要戴手套，戴手套，戴手套，重要的事情说三遍。根据经验，少量模板的加入，容易造成加样误差。所以为了尽量减少加入少量模板造成的误差，我们一般会将样本再稀释一倍，加样的时候多加一倍，减少 H2O  的加入量。
4、你确定你的 PCR 板和仪器配套吗？
你用的是 BIO-RAD 公司的定量 PCR 仪器，那么你一定要买配套该仪器的 qRT-PCR 板。因为不兼容的 PCR 板会导致结果偏差。这种状况实验小白尤其需要注意。


5、凝胶放入电泳槽有什么注意事项吗？
凝胶放入电泳槽时一定要注意方向，核酸是带负电的，所以电泳的方向是从负极向正极跑，因此，加样孔一定要对着负极放置，不然样本就跑到胶外面去了。
来源：医学院

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