实验步骤之——western blot

笑看风云

最近整理了跑WB的步骤，分享出来跟大家一起学习~
1. 提蛋白
1.1细胞
①将细胞培养皿置于冰上，用冰冷得PBS洗涤细胞2次
②吸出PBS，加入裂解液（碧云天P0013；1%TritonX-100；）
a.融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM，或者根据实验需要加入适当的上述蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物。
b.对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。按照6孔板每孔加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触动物细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。（一般10*7个细胞用100ul裂解后获得的上清蛋白浓度约为2-4mg/ml）
③用刮刀刮下贴壁细胞，转移至EP管，14000rpm离心5分钟
④将上清液转移至EP管，负20℃保存
1.2组织
①将组织样品剪成细小碎片（最好在冰上进行）
②加入裂解液
a.融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM，或者根据实验需要加入适当的上述蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物。
c.按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。)
d.用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。如果组织样品本身细小，可适当剪切后直接加入裂解液，通过强烈涡旋使样品裂解充分
（每20mg冻存的小鼠肝脏组织用200微升本裂解液裂解后获得的上清，其蛋白浓度约为15-25mg/ml，不同状态的不同组织有所不同）
③充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清
2. 蛋白定量（Thermo UF289356)
2.1稀释白蛋白(BSA)标准液的制备


2.2 制备BCA工作液（A液：B液=50：1 密闭室温可以保存一段时间）
总体积=（#标准孔+#未知孔）*#复孔*每个样本的体积
测试管每管2ml;96孔板每孔200ul。


2.3 浓度测定
①将25ul标准液和样本设置复孔加入96孔板，按照样本：BCA工作液（1：8）加入200ul BCA工作液(如果样本有限就加10ul比例用1：20；推荐每个待测的样本做2-3个平行反应；根据样品的浓度，可提前稀释5-10倍)
②最好摇匀30秒，将96孔板在37℃孵育30min
③冷却至室温，酶标仪设置为562nm，在5分钟内测试完所有的样本。
④所有的样本减去空白对照在562nm处的吸光度，绘制标准曲线，确定样本的浓度


3. 蛋白电泳
3.1 变性以及还原蛋白
在蛋白样品中加入含SDS（保证样品中的所有蛋白带电荷一致）的上样缓冲液，100℃加热煮沸。
3.1.1室温溶解蛋白上样缓冲液（5×），按照4 uL蛋白样品+1 ul (5×)的比例混合。
3.1.2 100℃或沸水浴加热10分钟，以充分变性蛋白
3.1.3 冰上骤冷，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔即可
3.1.4通常电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近则可以停止电泳
4. SDS-PAGE凝胶电泳
4.1 胶的选择与制备（根据目的蛋白的大小，选择合适的分离胶的浓度）


4.2 配胶（碧云天P0012AC）
洗干净玻璃板，装板加水验漏后，晾干装到制胶架上。根据配方配胶。
（配胶顺序：先配分离胶（下层胶），充分凝固后，再配浓缩胶（上层胶））






4.2.2 配制浓缩胶（上层胶）


4.2.3 组装制胶器
①将制备好的分离胶灌入制胶板内（缓慢不要有气泡），随后缓慢加入适量异丙醇压平分离胶。
②20-30分钟分离胶凝聚完成，倾斜板，倒掉异丙醇，吸水纸吸去残余液体，弃去上层压胶的水或醇。
③加入配好的浓缩胶灌入制胶板内，然后插上梳子，20-30分钟浓缩胶即可凝聚。
④缓慢取出梳子，上样。
4.2.4 上样及电泳
①蛋白冰上溶解，调整蛋白浓度，和等体积5×上样缓冲液混合，即为上样液。用纯水冲洗胶板，放入电泳槽
②两块板之间倒入电泳液，确认无漏液
③迅速拔出梳子，用枪轻轻吹孔使碎片冲出
④依次加入蛋白marker和蛋白样品，每孔加上样液20ug，留一孔加预染的marker.加满电泳缓冲液，盖上槽盖，接通电源，先用70V恒压电泳，约30min,当指示剂溴酚蓝进入分离胶后改用90V恒压电泳，当指示剂到达距凝胶下端约0.5cm处时关闭电源，取出胶板。（上样时间尽量短，避免样品扩散，但也不能过快避免样品溢出而造成相邻加样孔的交叉污染，未加样的孔中加入等量的样品缓冲液）
⑤调节电泳的电压和时间，传统胶是上层胶80V，30min;下层胶120V 90-120min.
(为了防止蛋白条带再凝胶上扩散，电泳后应尽快转膜)
5. 转膜
将蛋白凝胶中的蛋白，通过电流作用转移到转印膜上。由于蛋白凝胶本身易碎，蛋白条带容易子啊凝胶中扩散，而且抗体也不易于进入凝胶中与目的蛋白结合，所以需要在转印膜这样的固相载体上实现后续封闭、洗涤，显色等实验操作。


5.1 转膜
①将减好的PVDF膜用无水甲醇润湿30秒以上，然后用dd H2O漂洗2min,浸泡于转移缓冲液中5min后开始后续操作
②装配转膜三明治结构（在转移缓冲液中制备三明治可以避免气泡的产生）
黑面（负极）→海绵垫→3层滤纸→凝胶→转印膜→3层滤纸→海绵垫→红面（正极），每层之间不能有气泡。然后将三明治转移至电泳槽中，黑面对黑面。


③接上正负极，按膜向正极的方向将转移盒放入电转仪中，加入转膜缓冲液，将电转仪置于冰水中，200mA恒流转膜90min。
④转膜结束后，快速取出PVDF膜，置于5%BSA室温封闭2h。
⑤取出膜，于摇床上用TBST洗膜5min×3次。
（监测多个蛋白时候吗，建议切胶分别转膜）
5.2 转膜效果确认
5.2.1 丽春红S印迹膜染色法
与蛋白质的结合是可逆的，红色染料很容易被洗掉，不会影响后续WB检测。
①转膜结束后，先用笔标记marker,再将NC膜置于立春红染色液中，室温5-10分钟即可见红色条带，用洗涤缓冲液洗数次可洗掉红色条带进行后续实验，拍照，根据marker剪膜。
6. 封闭
转膜结束后，需要对转印膜进行封闭，在转印膜上未结合蛋白的位置，有许多非特异性的结合位点，未避免其与抗体发生非特异性结合引起高背景，需使用含有惰性蛋白质封闭杂交膜上的非特异性位点。
①配置封闭液：5%奶粉：2.5g脱脂奶粉加入到50ml现配的TBST溶液中摇匀
②绿色裁膜板上倒入一些TBST溶液，将PVDF膜放在裁膜板上，标记，裁膜
③加入封闭液置于水平摇床上，室温条件下震荡孵育60分钟，取出封闭完成的膜，用洗涤液冲洗杂交膜2-3次，即可用于一抗孵育等后续实验。
（磷酸化抗体不能用含磷酸酶的封闭液，不能用脱脂奶粉和BSA；生物素化抗体不能用脱脂奶粉；辣根过氧化物酶（HRP）检测体系，不能用含叠氮钠的封闭液，会发生淬灭反应）
7. 抗体封闭
①封闭后的杂交膜，首先孵育一抗，4℃孵育过夜或（22-25℃）摇动孵育2h
②用1×PBST/TBST液洗膜3次×10min
③孵育二抗，4℃孵育2h或室温（22-25℃）摇动孵育1h
（抗体查相应说明书确定稀释倍数）
8. 显影
①配置稀释液，将A液和B液按照（1：1）混合
②从TBST缓冲液中取出膜，去除膜上的多余缓冲液，但不要让膜干燥
③将有蛋白的一面朝上平整的铺在一张纸板上，加上配好的工作稀释液。用量以覆盖住膜为基准。
④将膜与工作稀释液孵育1-5min,确保整个表面覆盖
⑤去除多余的液体，用保鲜膜包好PVDF膜，暗室中X胶片感光显影定影。

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