干货学堂| Western blotting 实验攻略篇（二）

检验之星

上一篇度小傲为大家带来了关于WB实验攻略一，那么接下来我们继续更新实验攻略二。
WB实验流程

样品制备»»蛋白定量»»电泳 »»转膜 »»封闭»»抗体孵育»»发光显影
1、转膜



杂交膜的选择是决定 Western blot 成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于 Western blot 的膜主要有两种： NC 膜和PVDF 膜 。
聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜：与蛋白质亲和力高，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合，非常适合于低分子量蛋白的检测。
硝酸纤维素（nitrocellulose, NC）膜：NC 与蛋白质靠疏水作用结合；非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便。但结合在 NC 上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失；NC膜韧性较差，易损坏。
转膜时小心撬开电泳凝胶板，裁取整块分离胶并放入预冷的湿转缓冲液，选取大小适当的杂交膜，按“三明治”的形式从负极到正极，摆放顺序依次为：黑色板子-海绵-滤纸-分离胶-NC膜（或PVDF膜）-滤纸-海绵-红色板子，放入电泳槽中倒入缓冲液进行转膜。
2、封闭

杂交膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点，为防止这些位点与抗体非特异结合，一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合。选择封闭剂时应注意封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。最常用的封闭剂是 BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶和 Tween-20等。
一般将转好的膜取出后，用0.1% TBST润洗2-3次后，加入适量脱脂牛奶，室温或者 37℃缓慢摇荡1～2h，特殊情况也可 4℃过夜。
3、抗体孵育



一抗孵育：用封闭液将一抗稀释到说明书建议的稀释倍数，尽量避免一抗浓度过高从而导致非特异性条带的产生。加入稀释好的一抗，室温或 4℃在摇床上缓慢摇动孵育2h至过夜，抗体的孵育时间主要取决于抗体与蛋白的亲和性和蛋白的丰度值。孵育完成后，回收一抗，用 TBST润洗3次，去除非特异性结合的一抗，保证抗原抗体的特异性结合。
二抗孵育：封闭液将辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗稀释到合适浓度，室温下摇床孵育60 min后，用TBST重复润洗NC/PVDF膜3次，洗去多余二抗。
小傲家的二抗产品能够特异性结合完整的小鼠 /兔IgG 分子，也会与其他小鼠/兔免疫球蛋白的轻链结合，检测灵敏度高，本底低，且对其他种属IgG无明显交叉反应。
4、 发光显影



辣根过氧化物酶在H2O2的存在下，氧化化学发光物质鲁米诺生成一种过氧化物，过氧化物不稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中间体，当后者由激发态返回至基态，就会产生荧光。显影时，按1：1的比例将ECL发光剂中A液和B液混匀，用移液器吸取合适量的发光液至覆盖NC/PVDF膜，暗室内曝光、显影、定影。
小傲家的ECL发光试剂盒应用了不同于鲁米诺-H2O2体系体系的新型的增强剂和氧化剂，具有灵敏度极高，发光迅速，亮度强，稳定性好等特点，可使用较高的抗体稀释倍数（1:5000~1:10000），能够在很大程度上节约抗体，且试剂中不含有毒成分，实验安全性更高图片，且有不同灵敏等级任君挑选！！！
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