一、血液样本采集和血涂片制备

临床医师

一、血液样本采集和血涂片制备

一、血液生理概要

（1）血液组成

离体后的血液自然凝固，分离出来的淡黄色透明液体称为血清。
血液加抗凝剂后分离出来的淡黄色液体称为血浆。
血清与血浆差别是：血清缺少某些凝血因子，如凝血因子Ⅰ（纤维蛋白原）、Ⅱ（凝血酶原）、Ⅴ、Ⅷ等。
记忆技巧：`血清`缺`少`某些凝血因子，如1、2、5、8。

• 全血
  适用于临床血液学检查，如血细胞计数、分类和形态学检查等。
  
• 血浆
  
  
  
  • 适用于血浆生理性和病理性化学成分的测定，特别是内分泌激素测定；
    
  • 血浆除钙离子外，含有其他全部凝血因子，也适用于血栓与止血的检查。
    
  
  
• 血清
  适用于临床化学和临床免疫学检查。
  

正常人血量约为（70±10）ml／kg体重，成人约4～5L，约占体重的6%～8%，其中血浆占55%，血细胞占45%。
小儿血量与体重之比略高于成人，男性比女性血量稍多，但女性妊娠期间血量可增加23%～25%。
（2）血液理化性质

• 血液的红色来自红细胞内血红蛋白。
  
• 动脉血氧合血红蛋白含量较高，呈鲜红色；
  
• 静脉血还原血红蛋白含量高，呈暗红色。
  
• 严重贫血者血液红色变浅。
  
• 严重一氧化碳中毒或氰化物中毒者血液呈樱红色。
  
• 酸碱度：正常人血液pH值7.35～7.45，动脉血pH值7.40，静脉血pH值7.35。
  
• 血浆渗透量：正常人约为290～310mOsm／（kg·H20）。
  

（3）血液特性

• 正常人血液中红细胞呈均匀混悬状态。与红细胞膜表面的唾液酸根、正常血浆成分、血浆黏度及血流动力学等因素有关。
  
• 正常人全血黏度约为生理盐水黏度的4～5倍，血浆黏度约为生理盐水黏度的1.6倍。血液黏度与血细胞比容和血浆黏度有关，其中，血浆黏度受血浆中纤维蛋白原、球蛋白等大分子蛋白质的影响，它们的浓度越高，血浆黏度越高。
  

（4）血液生理功能

• 血液生理功能具有运输功能、协调功能、维护机体内环境稳定和防御功能、~~悬浮稳定性功能~~。
  

二、采血方法

（1）静脉采血法

• 静脉采血多采用位于体表的浅静脉，通常采用肘部静脉、手背静脉、内踝静脉或股静脉。
  
• 小儿可采颈外静脉血液。
  

（2）皮肤采血法

皮肤采血法曾称为毛细血管采血法，是采集微动脉、微静脉和毛细血管的混合血，同时含细胞间质和细胞内液。通常，选择耳垂或手指部位。手指采血操作方便，检查结果比较恒定。

• 世界卫生组织（WHO）推荐采集左手无名指指端内侧血液
  
• 婴幼儿可采集大拇指或足跟内外侧缘血液。
  
• 严重烧伤患者，可选择皮肤完整处采血。
  

注意事项
耳垂采血痛感较轻，操作方便，但血循环较差，受气温影响较大，检查结果不够恒定（如红细胞、白细胞、血红蛋白和血细胞比容等测定结果比手指血或静脉血高），一般情况下不宜使用。
因第1滴血混有组织液，应擦去。如血流不畅切勿用力挤压，以免造成组织液混入，影响结果的准确性。
进行多项检查时，采血的顺序依次为血小板计数、红细胞计数、血红蛋白测定、白细胞计数、血型鉴定等。
（3）真空采血法

盖子颜色	添加抗凝剂	注意事项	用途
​红色	无	凝块形成约30min	化学、血清学、血库
紫色	EDTA	须颠倒混匀6～8次	全血细胞计数（CBC）
淡蓝色	枸橼酸钠	须颠倒混匀；血液与抗凝比例为9:1	凝血检查（PT、APTT、因子测定）
绿色	肝素钠、肝素锂、肝素铵	根据实验需要，选择不同型的肝素	化学
​黄色	多茴香脑磺酸钠（SPS）	须颠倒混匀8次	血培养
深蓝色	无抗凝剂或肝素钠、EDTA	化学清洁的试管	毒理学、微量金属
金黄色	分离胶/凝块激活剂 须颠倒混匀5次，使血液与激活剂充分接触。凝块完全形成后离心	化学、不适于血库
淡绿色	分离胶/肝素锂	-	钾测定
橘黄色	凝血酶	须颠倒混匀8次	化学
黑色	​枸橼酸钠	血液与抗凝剂比例为4:1	血沉
棕色	肝素钠	铅浓度＜0.1μg/ml	铅测定
粉红色	无	-	血库
灰色	氟化钠、草酸钾	不能用于其他化学检查	葡萄糖、糖耐量、乙醇浓度

（4）方法学评价

1.皮肤采血

缺点是易于溶血、凝血、混入组织液，而且局部皮肤揉擦、针刺深度不一、个体皮肤厚度差异等都影响检查结果，所以，皮肤采血检查结果重复性差、准确性不好。
2.静脉采血

开放式采血法的操作环节多，难于规范统一，在移液和丢弃注射器时可能造成血液污染。封闭式采血法的操作规范，有利于样本收集运送和保存，防止院内血源性传染病。
（5）质量控制

1.患者

患者活动情况、精神状态、药物、年龄、性别、种族、样本采集时间、吸烟、季节等都会影响检测结果。
2.采血

止血带结扎时间应小于1min，如超过2min，大静脉血流受阻而使毛细血管内压增高，使分子质量＜5000的物质逸入组织液，或缺氧引起血液成分的变化，使检查结果不可靠。
3.溶血

因容器不洁、接触水、强力振荡、操作不慎等可引起溶血，使红细胞计数、血细胞比容、血浆或血清化学成分（如钾、镁、转氨酶、胆红素）等多项指标检验结果发生变化。
4.样本处理

血液样本采集后应立即送检，并尽快进行检查，样本保存不当直接影响实验结果。
5.实验结果分析

分析结果时，应考虑药物、饮食等因素对结果的影响。同时，应密切结合临床。
三、抗凝剂选择

1.乙二胺四乙酸（EDTA）盐

常用有钠盐（EDTA-Na2·H20）或钾盐（EDTA-K2·2H2O），能与血液中钙离子结合成螯合物，使Ca2＋失去凝血作用，阻止血液凝固。
EDTA盐对血细胞形态、血小板计数影响很小，适用于血液学检查，尤其是血小板计数。但钠盐溶解度低于钾盐，有时影响抗凝效果。
根据国际血液学标准化委员会（ICSH）建议，CBC抗凝剂用EDTA-K2·2H2O，量为1.5～2.2mg／ml血液。
不适于凝血检查、血小板功能试验。
【用自动血液分析仪时，首选的抗凝剂EDTA-K₂】
2.1草酸盐

常用有草酸钠、草酸钾、草酸铵，溶解后解离的草酸根离子能与样本中钙离子形成草酸钙沉淀，使Ca2＋失去凝血作用，阻止血液凝固。
草酸盐优点是溶解度好、价廉。
草酸盐对凝血因子V的保护作用差，影响凝血酶原时间测定，而且草酸盐与钙结合后形成的沉淀物，影响自动凝血仪检测结果，因此，草酸盐不适于凝血检查。
2.2双草酸盐抗凝剂

草酸钾可使红细胞体积缩小，草酸铵则可使红细胞胀大，两者按适当比例混合，恰好不影响红细胞形态和体积，可用于血细胞比容、CBC、网织红细胞计数等项目检查，若单用草酸钾或草酸钠作为抗凝剂，与肝素为抗凝剂测定的血细胞比容比较，测定结果可减低8%～13%。
双草酸盐抗凝剂可使血小板聚集、影响白细胞形态，不适于血小板计数、白细胞分类计数。
3.肝素

加强抗凝血酶（AT）灭活丝氨酸蛋白酶作用，阻止凝血酶的形成，并阻止血小板聚集等作用，从而阻止血液凝固。
肝素广泛存在于肺、肝、脾等几乎所有组织和血管周围肥大细胞和嗜碱性粒细胞颗粒中，带有较多负电荷。
肝素具有抗凝力强、不影响血细胞体积、不易溶血等优点，绝大多数检查都可用肝素作为抗凝剂，是红细胞渗透脆性试验的理想抗凝剂。
但肝素可引起白细胞聚集，瑞氏染色后产生蓝色背景，不适于CBC、细胞形态学检查。
每毫升血液肝素用量为（15±2.5）U，多为肝素钠盐或钾盐。
4.枸橼酸盐

常用有枸橼酸钠，能与血液中钙离子结合形成螯合物，阻止血液凝固。枸橼酸盐的溶解度低，抗凝力不如上述抗凝剂。
枸橼酸钠与血液的抗凝比例为1：9或1：4。适用于红细胞沉降率、凝血检查，是输血保养液的成分。
抗凝剂总结

抗凝剂	1.乙二胺四乙酸（EDTA）盐	2.草酸盐	3.双草酸盐抗凝剂	4.肝素
适用	形态、(CBC)	血小板计数	比容、CBC、Ret	红细胞渗透脆性试验
不适用	凝血、血小板功能	凝血、红细胞缩小	血小板（聚集）、白细胞分类计数	CBC、形态、引起白细胞聚集
考点	EDTA-Na溶解度 ≤EDTA-K（ICSH建议首选）	草酸钾0.8g，草酸铵1.2g／100ml

四、血液涂片制备

手工推片法

取血1滴置载玻片一端，以边缘平滑的推片，从血滴前方接触血液，使血液沿推片散开，通常推片与载玻片保持25°～30°夹角，平稳地向前推动，血液即在载玻片上形成薄层血膜。

• 涂片厚薄与血滴大小、推片与载玻片间夹角、推片速度、血细胞比容有关。
  
• 一张良好的血片，应厚薄适宜、头体尾明显、细胞分布均匀、血膜边缘整齐，并留有一定空隙、血膜长度占载玻片长度的3/4左右。
  

五、血液细胞染色

（1）瑞氏染色法

瑞氏染料：由酸性染料伊红（E－）和碱性染料亚甲蓝（M＋）组成。将适量伊红、美蓝溶解在甲醇中，即为瑞氏染料。甲醇的作用：一是溶解美蓝和伊红；二是固定细胞形态。
染色原理

既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用。各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。

• 如血红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；
  
• 细胞核蛋白、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞胞质为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色或蓝色，称为嗜碱性物质。
  
• 中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫红色，称为嗜中性物质；
  
• 原始红细胞、早幼红细胞胞质、核仁含较多酸性物质，染成较浓厚的蓝色；
  
• 中幼红细胞既含酸性物质，又含碱性物质，染成红蓝色或灰红色；
  
• 完全成熟红细胞，酸性物质彻底消失后，染成粉红色。
  

影响因素

• pH值的影响：
  
  
  
  • 细胞各种成分均属蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液pH而定。
    
  • 在偏酸性环境中正电荷增多，易与伊红结合，红细胞和嗜酸性粒细胞染色偏红，细胞核呈淡蓝色或不染色；
    
  • 在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝结合，所有细胞呈灰蓝色，颗粒呈深暗，嗜酸性颗粒呈暗褐，甚至棕黑色，中性颗粒偏粗，呈紫黑色。
    
  
  
• 稀释染液必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致细胞染色反应呈色异常，形态难以识别，甚至错误。
  

注意事项

• 冲洗时应以流水冲洗，不能先倒掉染液，以防染料沉着在血涂片上。
  
• 冲洗时间不能过久，以防脱色。
  
• 如血涂片上有染料颗粒沉积，可滴加甲醇，然后立即用流水冲洗。
  
• 染色过淡可以复染，复染时应先加缓冲液，然后加染液。
  
• 染色过深可用流水冲洗或浸泡，也可用甲醇脱色。
  

六、方法学评价

（1）血涂片制备

血涂片制备：手工推片法用血量少、操作简单，是应用最广泛的方法。
此外，疟原虫、微丝蚴等检查可采用厚血膜涂片法。
（2）血液细胞染色

• 瑞氏染色法是最经典、最常用的染色法，尤其对于细胞质成分、中性颗粒等可获得很好的染色效果，但对细胞核的着色能力略差。
  
• 吉姆萨染液对细胞核、寄生虫（如疟原虫等）着色较好，结构更清晰，但对细胞质成分的着色能力略差。
  
• 采用瑞氏-吉姆萨复合染液可使细胞胞质、颗粒、胞核等均获得满意的染色效果。
  

染色法总结

巴氏染色法	HE染色	吉姆萨染	瑞氏染色	吉姆萨复合染色法
妇科推片	癌细胞	细胞核、寄生虫	细胞质	胞质、胞核
泌尿系统肿瘤细胞	临床常用	复合染料

七、质量控制

（1）血涂片制备

• 血涂片制备：制备涂片时，血滴愈大、角度愈大、推片速度愈快，血膜愈厚，反之则愈薄。
  
• 血细胞比容增高、血液黏度较高时，应采用小血滴、小角度、慢推，可得满意结果；
  
• 血细胞比容减低、血液较稀时，应采用大血滴、大角度、快推。
  
• 血液细胞染色深浅与血涂片中细胞数量、血膜厚度、染色时间、染液浓度、pH值密切、室温、血细胞形态相关。
  

记忆技巧：血滴、夹角、速度、比容（越大越厚）。
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