RNA提取的基本原理?

wolf

RNA提取的基本原理?
原文地址：https://www.zhihu.com/question/330280762

检验医师

RNA提取原理

用Trizol 的溶液提取，将总RNA与 DNA 和蛋白质分离。Trizol 是一种酸性溶液，含有硫氰酸胍 (GITC)、苯酚和氯仿。GITC 不可逆地使蛋白质和 RNase 变性。随后进行离心。在酸性条件下，总 RNA 保留在上层水相中，而大部分 DNA 和蛋白质保留在中间相或下层有机相中。然后通过用异丙醇沉淀回收总 RNA。RNase 酶可以通过加入吡咯碳酸二乙酯 (DEPC) 来灭活。



RNA 分离所需的材料

• 氯仿
  
• 异丙醇溶液
  
• 无RNA酶水
  
• 75%乙醇
  
• 通风柜
  
• 涡旋器
  
• 微量移液器
  
• 冷冻微量离心机
  

提取步骤

• 组织：每 100 毫克新鲜组织加入 1 毫升 TRIzol 试剂，使用无菌手术刀在冰上切碎，并用无菌匀浆器或其他设备匀浆。
  
• 细胞：如果是细胞培养物，应在从培养箱中取出后立即进行处理。细胞在室温（15-25 ºC）下以 1000rpm 离心5 分钟，然后丢弃上清液或从单层生长的细胞中去除培养基，用预冷PBS洗一次。每 1 × 10<7> 细胞加入 1 ml TRIzol 试剂。
  
• 4°C 预冷离心机
  

• 将组织或细胞裂解液转移到 1.5毫升无RNA酶EP管中。置冰上，静置 5 分钟。
  
• 每管加入200ul氯仿，充分混合后冰上静置10分钟，使核蛋白复合物完全解离。
  
• 在 4°C 下以 13000 rpm离心 15 分钟。取一新EP管，加入500ul异丙醇，冰上预冷。
  
• 离心后，将上层水相 (约500 ul) 转移到该新的 EP管中。
  
• 冰上静置，酒精沉淀10min。
  
• 离心， 13000 rpm， 10 分钟。
  
• 去除上清液。用 1ml 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀一次。
  
• 12000rpm离心 5 分钟。
  
• 去掉上清，风干或真空干燥 RNA 沉淀 5-10 分钟。
  
• 将 RNA 溶解在30-50ul DEPC 处理过的去离子水中（需根据RNA沉淀的量加水溶解）。
  
• 进行分光光度分析以确定样品浓度和纯度。
  

继续前进

RNA是植物分子生物学研究的重要对象之一, 从植物中获得高质量的RNA是后续RT-PCR、Northern杂交、cDNA文库构建等分子生物学研究的基础。古人云：“合抱之木，生于毫末；九层之台，起于累土；千里之行，始于足下。”因此，只有从植物组织中提取纯度高、完整性好的RNA 才能为后续的研究提供良好的开端。
无论是新手还是老司机，在植物RNA提取实验中可能都遇到过或大或小的问题，这些问题不仅浪费额外的试剂和样本，还会消耗我们大量的精力和心血去处理和分析数据，常常把我们弄得手足无措。别慌！诺唯赞带领你击破各个难点，掌握植物RNA提取的几大法宝，成为大神指日可待！



植物RNA提取难点


1. RNA为单链结构且有2’-OH易发生化学反应，分子结构不稳定；
2. 一些植物组织中或富含酚类化合物或富含多糖或含有某些尚无法确定的次级代谢产物对提取产生干扰；
3. RNase的活性较高，遍布各处，不易清除。




（a）核糖核苷酸结构（b）RNA单链结构；（c）多糖多酚结构

万事开头难，既然知道植物RNA提取的难点之后，接下来就跟着小编的脚步，一起去探索解决办法吧！

植物RNA提取方法


1.Trizol法

利用提取液中异硫氰酸胍或苯酚的强变性氧化能力使细胞膜裂解、蛋白质变性，抑制内源RNase活性的发挥，同时使核酸释放于水相之中，通过沉淀法回收RNA。
优点：操作简单、RNA提取完整性好等优点，适用于一些次生代谢物含量少的植物组织。
缺点：多酚类物质在提取的过程中被氧化成棕褐色的醌类化合物，从而与核酸大分子不可逆结合，使用氯仿抽提去除多酚类物质的同时，造成RNA丢失[1]。

2.SDS-苯酚法

利用SDS和苯酚能够使蛋白质变性、抑制内源RNase活性的发挥，裂解细胞膜，可以将溶液中蛋白质、多糖、DNA 分离至有机相中[2]，而RNA则留在上清之中。
优点：操作简单，提取时间短。
缺点：在RNA提取过程中，产生较高含量的多酚类杂质，且所提取的植物总RNA无法进行反转录实验。

3.试剂盒法

利用盐酸胍裂解样本，抑制RNase的活性；β-巯基乙醇变性蛋白，通过离心柱上的吸附膜，特异性吸附RNA。
优点：操作简便、快速，安全、产物纯度高，可随时用于下游实验。
缺点：多数需要手动操作，可能会滤膜堵塞，对RNA大小有要求。

知道了这些提取方法之后，大家可以根据自己的样本类型和需求自由选择最合适的提取方法哟！接下来还有干货等着你们呢！

产物质量检测


浓度：产物浓度检测常见的方法包括紫外分光光度计测量和Qubit仪器检测；
PS：两者都操作简便，迅速，但无法区分降解核酸；紫外分光光度计测试成本低，易得到浓度虚高值。Qubit仪器测试成本高，价格较贵，但灵敏度较高。大家可以根据自己的需求选择合适的方法检测哟！
纯度：紫外分光光度计进行测量
OD260/OD280=1.9-2.1说明纯度很好；
OD260/OD280<1.9表明可能有蛋白质残留；
OD260/OD280>2.1表明RNA可能存在部分降解或者残留部分DNA，建议跑胶进行完整度检测；
OD260/OD230<2.0表明可能存在盐离子残留。
如果大家使用紫外分光光度计测量后对提取的RNA纯度把握不准，可以进行琼脂糖凝胶进一步验证是否存在蛋白、基因组或杂质残留；




左图箭头代表蛋白残留；右图箭头代表DNA残留。

完整度：琼脂糖凝胶电泳：1%琼脂糖




（a）完整RNA；（b）部分降解RNA；（c）严重降解RNA。

2100仪器检测：下游应用为qRT-PCR时，一般认为Rin≥5,说明RNA完整




不同样本提取RNA后的2100检测

植物RNA提取过程中应该注意的问题：


1.RNA降解

（1）选新鲜组织或细胞样本，避免反复冻融；组织离体后须迅速放入液氮中速存，后期转移至-80℃长期保存。
（2）未冻存样本立即加入裂解液匀浆裂解，冻存组织加入液氮充分研磨；样本投入量适当；无RNase操作。
（3）RNA分管尽快使用，电泳检测用无酶水进行冲洗，电泳缓冲液用RNA无酶水配置，提高电压并缩短跑胶时间。

2.RNA产量低

（1）样本保存不当或样本保存时间过久，或反复冻融导致降解，事先了解好提取样本中RNA含量水平，也可以采集新鲜样本或经过液氮速冻后保存于-70℃。
（2）匀浆或者液氮研磨不充分，导致样本没有完全裂解，RNA释放不充分。然而，并不是所有的样本都对相同的裂解方案敏感。例如淋巴细胞、PBMCs 等和微生物细胞往往很难有效裂解，仅仅添加裂解缓冲液可能并不够。为了提高裂解效果，可以将裂解缓冲液与机械裂解步骤（研磨珠破碎）匹配，或者在裂解液上游加入酶裂解步骤（如蛋白酶 K、溶菌酶等）。
（3）使用柱提法时，洗脱不充分，可以将RNase-free ddH2O滴加到纯化柱膜中央，纯化柱的洗脱体积为50-200 μL，若洗脱效果不理想，可以加入在55-70℃预热的RNase-free ddH2O后，延长室温放置时间，离心后进行第二次洗脱。

3.RNA出现基因组污染

（1）柱提法：减少样本起始投入量，DNaseI膜上消化。
（2）Trizol法：向裂解液中加入氯仿后，需要在低温下高速离心；向裂解液中加入氯仿后，RNA分层，避免吸到中间层和下层。

参考文献：
[1] 刘芳,官春云.富含多酚类植物RNA提取的研究进展[J].作物研究,2015,29(01):91-95+100.
[2] Lewinsohn E , Steele C L , Croteau R . Simple isolation of functional RNA from woody stems of gymnosperms[J]. Plant molecular biology reporter (USA), 1994, 12(1):20-25.

同花顺

Trizol法提取RNA
提取RNA可以用于后续的反转录成cDNA、实时定量PCR、提取目的基因、构建载体和遗传转化等内容。因此，RNA的提取是基因工程中重要的实验之一。在实践过程中，RNA也相对于DNA更难提取，由于RNA酶在环境中大量存在，因此在提取RNA过程中要特别注意，以免污染而被降解。

继续前进

Trizol就是酚氯仿提取法的常用试剂
Trizol中有酚，异硫氰酸胍和B-巯基乙醇。他们的作用都是使蛋白变性，使蛋白质与核酸解聚。加入氯仿，用来分相，实际上是加速有机相和水相的分层，当溶液pH在酸性的时候，DNA分子就会沉淀在酚与溶液的界面，就是白色层，只有RNA分子留在水相，但溶液pH不在酸性范围内，会使DNA溶解在水相，所以使用时按照说明书要求根据细胞数或培养器皿底面积适量加入Trizol。最后异丙醇沉淀，将水相中RNA提取出来。

同花顺

只说氯仿抽提，柱子抽提不算。
原理就是相似相溶的萃取技术，rna亲水性，trizol裂解细胞的溶液和氯仿混匀以后离心，水相留在上面，其中包含rna。收集水相以后加入异丙醇或者乙醇夺取水，rna析出。