DNA提取（CTAB法）

临床医师

实验原理
CTAB是一种非离子去污剂可与DNA形成复合物，此复合物在高浓度氯化钠溶液（20.7mM）下可溶，并稳定存在，但在低浓度下（0.1—0.5mM）沉淀，而大部分蛋白质、多糖仍溶于溶液中，经离心弃上清后，CTAB核酸复合物，用75%乙醇浸泡脱掉CTAB。

实验步骤：

注：夏天取新鲜叶片时应带冰盒，将取下叶片立刻放冰上，防止过度失水，另外取材尽量取用嫩组织。
1）取约1cm2的新鲜的幼嫩叶片于研钵，向研钵中加入600µl预热的 2%的CTAB分离缓冲液和12ul的β—巯基乙醇（2%），研磨成浆，倒入1.5ml的离心管中。
1.此步主要是充分破坏细胞壁，使CTAB充分接触细胞膜。
2.此方法为小量法，样品的量要必须符合要求。
3.裂解时间尽量要短。
4.CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
5.转移时可用剪去尖端的枪头吸取。
（2）将离心管置于65℃水浴30min，其间每隔10min轻轻摇晃离心管，使其充分混匀
使CTAB充分破坏细胞膜，与DNA结合形成复合物溶于高盐溶液。
(3）加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），颠倒摇晃5min。
(4）12000r/min离心10min，收集上清
降至室温后，再加酚/氯仿/异戊醇。4℃离心更容易去蛋白，故凡是抽提蛋白的，都可运用此条件。此后不再赘述。另外收集上清时应调小枪头（50ul即可），缓慢吸取。此后不再赘述。
(5)加等体积酚/氯仿（1:1），混匀，12000r·min-1离心10min，取上清。
(6)加等体积氯仿/异戊醇（24：1），混匀，12000r·min-1离心10min，取上清
此步氯仿是为了除去上步残余的酚。
(7）向上清中加入两倍体积预先冰冻的无水乙醇或一倍体积的异丙醇，置于-20℃冰冻30min。
降低CTAB的浓度，使DNA析出到难溶的乙醇中。加入醇类使其终浓度为70%左右沉淀效果最好。若杂质含量较多，可采用室温沉淀。异丙醇沉淀较完全，但难洗涤，适合小量提取DNA沉淀。另外沉淀时间不是很严格，DNA可以在其中长期保存，但若想减少杂质含量尽量不要过长。
(8）12000r/min离心10min，弃上清，加入75%的乙醇，悬浮沉淀，常温下静置5min，弃上清。
离心之前将液体吸出，可以减少杂质的含量。但吸的时候一定注视枪头尖部，不要把DNA吸走了。另外离心获得的沉淀呈现透明状，似果冻，若有粉末状物质则可能蛋白质未抽提干净。
(9）室温干燥，溶于20µl 无菌水中，然后加入1/10体积的RNAase（1mg/ml）37℃处理40min后-20℃保存备用
晾干之前，可短暂离心，将管壁乙醇聚集底部，后用移液枪吸去，能够最大限度的减少乙醇的存在，加速晾干。晾干的标准是无酒精味即可，不可晾的时间过长。

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