用WB检测蛋白为啥还要检测磷酸化蛋白?

balabala

用WB检测蛋白为啥还要检测磷酸化蛋白?
原文地址：https://www.zhihu.com/question/493846479

继续前进

刚好在实验室刚分享过磷酸化蛋白wb的经验，这里我也回答下， 希望能帮到题主！
一、为啥要检测磷酸化蛋白？先来了解下磷酸化蛋白的背景知识

蛋白质是组成人体细胞、组织的重要成分，新的蛋白质多肽要转变为成熟蛋白质，需要经过蛋白翻译后修饰。
翻译后修饰包括：磷酸化、糖基化、甲基化、羟基化、脂酰化、羧基化等共价修饰。其中蛋白质磷酸化是重要的蛋白质翻译后修饰之一。


蛋白质磷酸化由蛋白质激酶所催化，磷酸化多发生在多肽链丝氨酸，苏氨酸的羟基上，偶尔也发生在酪氨酸残基上，这种磷酸化的过程受细胞内一种蛋白激酶催化，磷酸化后的蛋白质可以增加或降低它们的活性。
例如：促进糖原分解的磷酸化酶，无活性的磷酸化酶b经磷酸化以后，变成有活性的磷酸化酶a。而有活性的糖原合成酶I经磷酸化以后变成无活性的糖原合成酶D，共同调节糖原的合成与分解。


蛋白质磷酸化是一种动态的生物调节过程，磷酸化涉及细胞信号转导、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、发育和分化等生理病理过程。
在细胞中，大约有1/3的蛋白质被认为是经过磷酸化修饰的。由激酶催化的磷酸化和由磷酸酶催化的去磷酸化是控制细胞周期的关键。细胞周期调控途径由一系列激酶和磷酸酶组成，它们通过将途径的下一个底物磷酸化和去磷酸化而对外来信号和检验点做出反应。


二、用WB检测蛋白质磷酸化

WB几乎是广大科研人的必修实验技术，普通蛋白的WB或许可以做的得心应手，但是做磷酸化蛋白WB经常会出现曝不出条带的情况！
WB检测蛋白质磷酸化其实和跑正常蛋白的大体步骤没什么出入，只不过孵育的是识别磷酸化的抗体。但是由于磷酸化蛋白反应快，降解快，表达量少，就有非常多的小细节需要格外注意！
我们之前分享过非常非常详细的WB教程，有需要可以看以下文章：

实验室祖传！Western Blot 实验全流程步骤+常见问题解决方案！

WB（蛋白质免疫印迹法）是定性测量蛋白质磷酸化水平的金标准。通过SDS-PAGE分离蛋白质后，当施加电压时，蛋白质从凝胶转移到膜上。通过将识别目标蛋白质磷酸化的抗体添加到膜中。然后，磷酸化抗体与辣根过氧化物酶 （HRP）偶联的二抗结合。当添加HRP底物时，可以检测到抗体结合了磷酸化的蛋白质，从而产生化学发光。



1、样品制备重点

①先弄清楚样品中磷酸化蛋白表达情况
可以利用PhosphoSitePlus（https://www.phosphosite.org/homeAction.action）数据库查询蛋白的磷酸化情况。PhosphoSitePlus当中关于翻译后修饰的信息主要来自于具体的实验结果以及高通量测序的预测，包括磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化等。可以查阅修饰类蛋白的表达条件和丰度、刺激方式等。


样品的磷酸化水平表达一般都非常低，有些甚至不表达，这个时候可通过物理或化学方法进行一定的刺激和诱导，刺激条件各不相同，刺激的时间和强度需要自己查文献和进行预实验来确定，要确保这个样品本身能检测出目的蛋白。
注意，刺激并越多越好，要做到充分但不过分（如磷酸化IRS1，仅需刺激5min，刺激过久会进入负反馈机制进而开始降解），正确刺激会帮助我们得到最佳实验结果。
有合适的阳性对照至关重要，在任何实验中，我们都应考虑包含适当的阳性和阴性对照，可以进一步确定抗体检测到的特异性信号。

如CST官网就有详细的刺激方法和阳性对照。
链接：https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/control-treatments-by-target

② 磷酸化蛋白样品提取&保存

• 取样要快、准、冷
  

蛋白的磷酸化是一个非常迅速的反应，磷酸化蛋白在室温条件下很容易被蛋白磷酸酶降解，即便加入磷酸酶抑制剂也很明显。所以取样品的过程要迅速，样品要新鲜（新鲜的样品制备提取物背景较低），样品处理最好在全程冰上操作，操作时间尽量短。用PBS洗涤细胞时，PBS一定要4 ℃预冷。如果是组织的话，提取蛋白时采用液氮研磨的方法，研磨器具最好提前预冷，保持低温的状态。

• 抑制磷酸酶的干扰
  

提取磷酸化蛋白的裂解液最好是新鲜配制，现配现用。且裂解液中一定要有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，因为组织或细胞裂解时会释放出大量内源性蛋白磷酸酶，它可以催化磷酸化蛋白的去磷酸化，否则即使条带压出来也会很浅，结果也不可信（okadaic acid，NaF磷酸酶抑制剂）。外源性的磷酸酶主要是由实验过程中的其它试剂带入的，比如要确保实验试剂中不含磷酸酶等；此外，样品中或其它试剂中带的细菌也会分泌外源性的磷酸酶，所以另一个关键是要尽量使用无菌清洁的试剂和凝胶，必要时加入防腐剂。

• 弄清检测的蛋白磷酸化位点是什么氨基酸
  

如果是酪氨酸还要加1µmol/L的 Na3VO4（原钒酸钠）。有些磷酸化抗体会注明上样前不要煮沸，煮沸可能会破坏其磷酸化位点。

• 裂解液裂解+超声处理可确保整个细胞充分裂解并剪切染色质DNA
  

经过超声处理过的样本得到的结果更清晰。建议在35%-40%的功率输出条件下超声3次，每次10s。由于不同仪器不同性能，要根据生产商的建议进行优化。超声处理时应保持低温，冰上操作。如果没有探头超声仪，也可以用细的注射器针头反复吹打也能起到类似的作用。

• 提取的磷酸化蛋白一定要妥善保存
  

最好是收集完成后马上变性并于-80 ℃分装保存，以保证降解程度最小。同时避免反复冻溶导致磷酸基团的降解。

2、Western Blot 操作过程中的其它问题

①上样的2个注意点

• 上样量要足
  

磷酸化蛋白的表达丰度较低，一般只有总蛋白量的10%，甚至更低，一定要确保每个凝胶孔中有足够的目的蛋白上样量。

• 加入磷酸化酶抑制剂
  

磷酸化蛋白容易脱磷酸化，除提取蛋白时要迅速小心外，也可在上样缓冲液和转移缓冲液中加入磷酸化酶抑制剂Na3VO4等。
②封闭剂的选择
一般的脱脂奶粉中含有大量的酪蛋白，是一种磷酸化蛋白，如果要WB检测磷酸化蛋白的话，就最好别用脱脂奶，否则会产生高背景（当然很多人用牛奶封闭出现问题也可能是因为用了非实验级奶粉）。根据经验来看，WB检测磷酸化蛋白时，BSA的封闭效果比脱脂牛奶好。
③抗体孵育

• 一抗4 ℃过夜，二抗室温1 h
  

因为磷酸化蛋白只占总蛋白量的极少部分，加入一抗后最好4 ℃过夜，过夜可保证充分结合进而曝出更漂亮的条带。同时4 ℃也可以使一抗重复使用多次，毕竟磷酸化抗体都挺贵的。二抗则室温1 h即可。
选择4 ℃过夜的主要原因是蛋白抗原不容易从膜上脱落。蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附属热力学范畴，高温下容易脱落。而抗体-抗原结合是热力学与动力学问题，高温容易结合是热力学范畴，抗体、抗原浓度却是动力学范畴。膜上的抗原脱落了，结合效率会低。

• 抗体稀释尽量降低二抗的浓度
  

请务必根据产品说明书中推荐的稀释液稀释一抗，不同产品有不同最佳稀释液。
使用浓度过高的二抗可能导致与目标蛋白以外的蛋白质的非特异性结合。任何蛋白质都可能发生非特异性结合从而导致更高和更低分子量的条带出现。推荐使用1：5000-1：20000范围内的二抗稀释度。同时可以设置一个对照，就是不孵一抗，只孵二抗的对照组，从而确保抗体的特异性。
④关于洗脱
一定要注意，膜一定要完全泡在洗脱液中（可用较硬的塑料膜封好），然后要完全浸入水中，让膜受热均匀。这一点很重要，要不然压出来的总蛋白、内标会不均一，无法进行比较，影响我们的结果分析。
洗脱液是用来去除已结合的抗体，但也会去除部分的蛋白，导致蛋白信号变弱。实验发现水浴有时温度不稳定，温度定为55 ℃时往往其温度容易超过，导致较多的蛋白也被去除。建议温度设为50 ℃，30 min，既能有效去除已结合的抗体，又比55 ℃更能保护蛋白。
抗体洗脱液配方：取0.5mol/L的Tris-Hcl（pH=6.8）25ml、4g SDS和1.4ml β-巯基乙醇，加纯水定容至200mL。
⑤磷酸化抗体选择

• 区分非磷酸化的抗体和磷酸化的抗体
  

一般原则是非磷酸化的抗体既可以识别非磷酸化的蛋白，也可以识别磷酸化的蛋白。磷酸化的抗体只能识别磷酸化的蛋白，而不能识别非磷酸化的蛋白。当然由于抗体识别表位的原因，不排除有些非磷酸化的抗体只能识别非磷酸化的蛋白，不能识别磷酸化的蛋白。

• 选择对应的磷酸化位点的抗体
  

如IkBα的主要磷酸化位点包括S32、S36和Y42。因此在选择磷酸化抗体之前，一定要先查阅文献在你的实验条件下或者预测目的蛋白是发生哪种位点的磷酸化，或者根据磷酸激酶来判断可能的磷酸化位点。

• 磷酸化抗体的说明书一定要仔细看
  

并最好根据厂商的操作说明来操作实验，这是实验成功的保证。因为不同的磷酸化抗体公司推荐的操作步骤不同。比如CST的一些抗体是脱脂奶粉封闭，一抗、二抗用BSA配制。
最最重要的是，抗体质量一定要好，特异性强，效价高；同时是经过验证，发表过文章的抗体，这样结果自然容易很多。

3、总蛋白和内参对照都要做

• 磷酸化蛋白检测需要设置两个内参
  

一个是磷酸化蛋白对应的总蛋白，比如你要检测Akt磷酸化，那你就要同时跑一个Akt的蛋白和Akt磷酸化的抗体，仅仅是检测到磷酸化蛋白表达量的变化不能说明问题，只有磷酸化蛋白与总蛋白比值变化了才能说明磷酸化水平发生变化了。
一方面，检测总蛋白可以验证目标蛋白在样本中是否存在；另一方面，通过对蛋白总量的检测，计算磷酸化蛋白/总蛋白比例可作为蛋白质磷酸化程度的指标，来判断样本中靶标蛋白磷酸化程度，可为后续结果分析提供依据。如未检测到磷酸化信号以及靶标蛋白总量，可能是样本中没有靶标蛋白；或者根据靶标蛋白总量以及磷酸化蛋白含量，分析刺激或诱导对靶标蛋白磷酸化水平的影响。
另一个是普通内参比如actin和GAPDH等，普通内参是作为体系的对照，保证上样量一致从而排除体系本身的影响。



DOI: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2019.06.003

Western blotting检测PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT表达

• 研究总蛋白有两种方法
  

①相同的样品在不同的孔中上样两次（可在相同的胶上，也可在不同的胶上），其一压磷酸化蛋白，另一压该蛋白总的表达量（包括磷酸化和未磷酸化的该蛋白），甚至还可跑另一个胶，压内标。但是一般不建议如此做，因为这样比较时误差还是较大的。
②比较常用的方法是用洗脱液将原先结合上的磷酸化抗体及二抗洗去，然后用同一张膜压总蛋白。然后再洗脱一次，再压内标。

4、影响WB背景和条带的关键因素

①背景颜色深
上样体积较小，导致曝光时间增加，背景颜色深。
磷酸化蛋白WB时背景也往往较深，所以压片时间要适当，不能太长或过短，太长则背景太深盖住想要的那条带，时间过短则可能没有条带或者条带太浅。
洗膜条件会影响背景：一抗和二抗均建议用1*TBST （相对于PBST缓冲液，最终信号会更强）洗膜3次，每次5min。洗膜时间不宜过长或过短，过长会导致信号减弱（抗体从结合的位点脱落），过短则会导致背景深。另外，洗膜的时候，盒子要比膜稍微大一圈，保证膜充分的在洗涤液中晃动，且建议单张洗膜而非几张一起清洗。
②杂带、非特异性条带
杂带较多，无明显目标条带，这可能是由于将样本长期保存，其中的磷酸化蛋白已经发生降解，无法检测出目标条带。
做磷酸化蛋白WB时，除了目标蛋白的条带以外，往往会出现非特异性的条带。磷酸化抗体不好的话，甚至会压出非特异性的条带，反而没有你想要的条带，所以压片后，一定要根据Markers比对一下压出的条带分子量是否正确。
③条带很浅或者完全没有条带
有些蛋白的磷酸化很低甚至不表达，需要做刺激处理；如果再加上样品上样量较少，保存时间过长，就会影响实验结果，出现完全没有条带的情况。
组织或细胞裂解时会释放出大量内源性蛋白磷酸酶，它可以催化磷酸化蛋白的去磷酸化，所以裂解液中一定要有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，维护蛋白质的磷酸化状态。否则条带会很浅，结果也不可信。

三、补充内容

WB和流式细胞术检测蛋白磷酸化的区别是什么？
流式是唯一的单细胞磷酸化分析技术，WB需要裂解细胞提取蛋白质分析。WB检测反映的是整个细胞群体蛋白质磷酸化状态的平均值，无法收集一个群体中单个细胞蛋白质磷酸化的信息，也没有能力追溯和识别磷酸化蛋白质相对应的细胞群体。
如下图所示：流式分析和WB分析的差异

• 在这个假设的实验中，获得了三个样品，它们含有一种感兴趣的蛋白质在1,10，每个单元格10份或50份，如所示。每个细胞的蛋白质分子平均数为1，样本2和样本3均为5。
  
• 当通过 Western印迹分析这些细胞群时，样品2和3将显示较暗的条带，但彼此看起来相同。
  
• 然而，当用荧光标记的抗体对样品进行蛋白质染色并通过流式细胞仪进行分析时，可以清楚地看到样品2包含两个不同群体的细胞，这两个群体具有相同的代表性，而在样品3中，只有大约1/10的细胞具有较高的蛋白质水平。样品中的这种异质性可能是由于不同的细胞类型(即免疫细胞)，或者是由于全或无类型的信号反应。
  

DOI: 10.1016/j.clim.2003.11.009

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感恩由您

Wsetern Blot几乎是广大科研人的必修技术，普通蛋白的WB或许可以做的得心应手，但是往往有些磷酸化的蛋白却怎么都做不出来。
本来WB 实验就已经够让人头秃的了，但WB 检测中还有一个疑难杂症——磷酸化蛋白检测。这才是真正检验小伙伴们WB实验操作水平的部分。
磷酸化蛋白表达水平量少、可逆磷酸化的出现及磷酸化易被蛋白磷酸酶降解的特性决定了这类蛋白印迹实验的特殊性；在检测过程中我们除了要遵循常规的 WB 注意事项外，还需要额外地对实验流程进行一些优化。
我们先了解下磷酸化蛋白的概念：

蛋白质激酶催化的把ATP的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基（丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸）上的过程，或者在信号作用下结合GTP，是生物体内一种普通的调节方式，在细胞信号转导的过程中起重要作用。蛋白质磷酸化是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的机制。
蛋白质磷酸化对于多种生物进程的引发（如：细胞生长、增殖、泛素介导的蛋白降解）是具有重要作用的。细胞信号转导活动都是由一系列蛋白传递链构成的，信号传导的过程中涉及到多种蛋白质的可逆磷酸化过程。蛋白质通过可逆磷酸化，以及不同的级联反应，可以将信号放大传递等。由此可见蛋白质磷酸化在细胞信号传导过程中担负着重要的作用。



蛋白磷酸化示意图

<hr/>接下来我们会详细讲解磷酸化蛋白WB的注意事项，希望能够对大家有所帮助~
磷酸化蛋白样品，裂解液问题

蛋白的磷酸化是一个非常迅速的反应，所以取样品的过程要迅速，样品要新鲜，样品处理最好在冰上操作，操作时间尽量短。用PBS洗涤细胞时，PBS一定要4 ℃预冷。如果是组织的话，提取蛋白时采用液氮研磨的方法，研磨器具最好提前预冷，保持低温的状态。
提取磷酸化蛋白的裂解液最好是新鲜配制，裂解液中一定要有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，否则即使条带压出来也会很浅，结果也不可信。
okadaic acid，NaF是磷酸酶抑制剂。再者，还要看检测的蛋白磷酸化位点是什么氨基酸，如果是酪氨酸还要加1 uM的sodium vanidate即原钒酸钠，上样前不要煮沸，煮沸可能会破坏其磷酸化位点。
提取的磷酸化蛋白一定要妥善保存，最好是收集完成后马上变性并于-80 ℃分装保存，以保证降解程度最小。同时避免反复冻溶导致磷酸基团的降解。
<hr/>Western Blot操作问题

磷酸化蛋白的表达丰度较低，一般只有总蛋白量的10%，甚至更低，一定要确保每个凝胶孔中有足够的目的蛋白上样量。
磷酸化蛋白容易脱磷酸化，除提取蛋白时要迅速小心外，也可在上样缓冲液和转移缓冲液中加入磷酸化酶抑制剂Na3VO4等。
磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。好抗体，傻瓜也能做出来，不好的抗体神仙也无办法。有些公司的抗体很好，有些公司的抗体很差（一些大公司同样会有低劣产品），而且这一点对非磷酸化的抗原检测也很重要。
因为磷酸化蛋白只占总蛋白量的极少部分，加入一抗后最好4 ℃过夜，保证抗体有充分的结合时间。4 ℃也可以使一抗重复使用多次。毕竟磷酸化抗体都挺贵的。二抗则室温1 h即可。4 ℃过夜，主要原因不是使抗体结合更好，而是蛋白抗原不容易从膜上脱落。蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附属热力学范畴，高温下容易脱落。而抗体-抗原结合是热力学与动力学问题，高温容易结合是热力学范畴，抗体、抗原浓度却是动力学范畴。膜上的抗原脱落了，结合效率会低。
磷酸化蛋白WB时，用洗涤液漂洗时也要注意一下，摇床的转速不要太快，洗的时间不要太长，孵育一抗和二抗之后分别洗3次，每次5 min即可。宁愿深一些，总比做不出来强得多。另外，洗的时候，最好不要把几张膜叠在一起洗。
<hr/>内参的问题

磷酸化蛋白检测需要设置两个内参，一个是磷酸化蛋白对应的总蛋白，比如你要检测Akt磷酸化，那你就要同时跑一个Akt的蛋白和Akt磷酸化的抗体，仅仅是检测到磷酸化蛋白表达量的变化不能说明问题，只有磷酸化蛋白与总蛋白比值变化了才能说明磷酸化水平发生变化了；
另一个是普通内参比如actin和GAPDH等。普通内参是作为体系的对照，保证上样量一致从而排除体系本身的影响，对于结果分析很重要。



低剂量LBH589通过PI3K/AKT途径诱导对上皮性卵巢癌细胞凋亡作用机制研究 (bbmc.edu.cn)

<hr/>磷酸化抗体的说明书

磷酸化抗体的说明书一定要仔细看，并最好根据厂商的操作说明来操作实验，这是实验成功的保证。因为不同的磷酸化抗体公司推荐的操作步骤不同。比如CST的一些抗体是脱脂奶粉封闭，一抗、二抗用BSA配制。
<hr/>WB时背景和条带的问题

磷酸化蛋白WB时背景也往往较深，所以压片时间要适当，不能太长或过短，太长则背景太深盖住想要的那条带，时间过短则可能没有条带或者条带太浅。
洗涤液对最后的背景影响也较大，密理博（millipore）最近的说明书推荐用双蒸水洗涤，对比了TBST洗涤的膜，效果有一定差距，背景有效降低，即便压片30min，背景仍然是可以忽略的。可能是双蒸水充分减少了ECL反映中其他缓冲液的影响，应该是可取的。
做磷酸化蛋白WB时，除了目标蛋白的条带以外，往往会出现非特异性的条带。磷酸化抗体不好的话，甚至会压出非特异性的条带，反而没有你想要的条带，所以压片后，一定要根据Markers比对一下压出的条带分子量是否正确。
<hr/>蛋白总的表达量问题

研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量。这有两种方法，一是：相同的样品在不同的孔中上样两次（可在相同的胶上，也可在不同的胶上），其一压磷酸化蛋白，另一压该蛋白总的表达量（包括磷酸化和未磷酸化的该蛋白），甚至还可跑另一个胶，压内标。
但是一般不建议如此做，因为这样比较时误差还是较大的。因此，比较公认的，也是常用的方法，即用strip液将原先结合上的磷酸化抗体及二抗洗去，然后用同一张膜压总蛋白。然后再洗脱一次，再压内标。
<hr/>Strip时的问题

Strip时一定要注意，膜一定要完全泡在strip solution中（可用较硬的塑料膜封好），然后要完全浸入水中，使受热均匀。这一点很重要，要不然，随后压出来的总蛋白也好，内标也好就会不均一，无法进行比较。
strip液是用来去除已结合的抗体，但也会去除部分的蛋白，导致蛋白信号变弱。实验发现水浴有时温度不稳定，温度定为55 ℃时往往其温度容易超过，导致较多的蛋白也被去除，故建议温度设为50 ℃，30 min，既能有效去除已结合的抗体，又比55 ℃更能保护蛋白。

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同花顺

在前面的推文中，我已经详细地讲解了Western blot实验原理和过程，指路：
最全 Western blot 实验手册（上）
最全 Western blot 实验手册（下）
今天我们来聊聊磷酸化蛋白检测那点事儿
蛋白磷酸化是一种非常重要的翻译后加工，做信号通路必然是要检测蛋白磷酸化的，Western blot是评估蛋白磷酸化状态的最常用方法，其实和跑正常蛋白没什么出入，只不过孵育的是识别磷酸化的抗体，下面总结一下实验中要避的雷....
熊叔毒鸡汤：没有不进取的科研人儿，只有不进取的磷酸化抗体！
一、先弄明白样品中磷酸化蛋白表达情况
样品的磷酸化水平一般都比较低或压根不表达，这个时候可通过物理或化学方法进行一定的刺激和诱导，刺激条件各不相同，刺激的时间和强度需要自己查文献和进行预实验来确定，前提是要确保这个样品本身是能检测出目的蛋白的。可以利用PhosphoSitePlus数据库（https://www.phosphosite.org）查询蛋白的磷酸化情况。


实验时别忘了设置阳性和阴性对照，可进一步确定抗体检测到的信号的特异性。
二、提取磷酸化蛋白要注意哪些事儿？
1、快、准、冷：蛋白的磷酸化是一个快反应，所以制样的过程要迅速，样品要新鲜，全程冰上操作。用PBS洗涤细胞时，PBS一定要4℃预冷。
如果样品来源是组织，提取蛋白时采用液氮研磨的方法，研磨器具也要提前预冷。
2、蛋白酶抑制剂：组织或细胞裂解时会释放出大量内源性蛋白磷酸酶，能催化磷酸化蛋白的去磷酸化，这就没办法体现样品体内的生理状态磷酸化差异。所以提取磷酸化蛋白的裂解液要新鲜配制，避免反复冻融。裂解液中一定要有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，否则即使条带出来也会很浅，结果可信度不高。另外，还要注意检测蛋白磷酸化位点是什么氨基酸，如果是酪氨酸还要加1µmol/L的原钒酸钠（sodium vanidate）。有的磷酸化抗体会特意注明上样前不要煮沸，煮沸可能会破坏其磷酸化位点。提取的磷酸化蛋白需要尽快变性蛋白并于-80℃分装保存，同时避免反复冻融导致磷酸基团的降解。
三、内参的问题
磷酸化蛋白检测需要设置两个内参，一个是磷酸化蛋白对应的总蛋白，比如你要检测Akt磷酸化，那你就要同时跑一个Akt的蛋白和Akt磷酸化的抗体，仅仅是检测到磷酸化蛋白表达量的变化不能说明问题，只有磷酸化蛋白与总蛋白比值变化了才能说明磷酸化水平发生变化了；另一个是普通内参比如actin和GAPDH等。普通内参是作为体系的对照，保证上样量一致从而排除体系本身的影响，对于结果分析很重要。



低剂量LBH589通过PI3K/AKT途径诱导对上皮性卵巢癌细胞凋亡作用机制研究 (bbmc.edu.cn)

四、Western Blot 操作过程中的问题
首先由于磷酸化蛋白的丰度较低，大概只有总蛋白量的10%，甚至更低，所以有时候为了能发出磷酸化条带，我们需要每个孔上足够蛋白量；
不得不强调，决定磷酸化发的好不好关键在磷酸化抗体（被坑了无数次的同学请举个手....），所以要选择paper里用的比较好的。
转膜后，用5%BSA（TBST溶解）进行封闭1h，非实验级别的奶粉可能含有磷酸酶等杂质，不适用于磷酸化蛋白的检测。另外避免膜封闭时间过长，可能会掩盖抗原表位，阻止抗体结合。用洗涤时摇床的转速不能太快，洗涤的时间不能太长。根据实验情况可加大一抗浓度以及孵育时间。
实验急不得，磷酸化检测更是急不得，4℃抗体孵育过夜的好处不仅使抗体有充足时间结合，而且低温环境下使蛋白抗原在膜上稳定不容易脱落，原因是蛋白抗原靠物理吸附作用停留在PVDF膜上，高温下PVDF膜上蛋白容易脱落导致抗原抗体结合效率降低。
五、抗体孵育和洗脱要注意的事儿
磷酸化蛋白和其对应总蛋白的条带位置基本是一致的。以标准的磷酸化WB来说，在检测完磷酸化抗体后，应该用抗体剥脱液（stripping buffer）洗脱抗体后，再孵总蛋白抗体。抗体剥脱液可以选择自己配制或购买商业化的试剂。
抗体剥脱液配方：取0.76g Tris-base、2g SDS和700µL β-巯基乙醇，加蒸馏水至100mL，用盐酸调整pH到6.8。
抗体洗脱液用来去除已结合的抗体，但也会去除部分蛋白，导致蛋白信号变弱。实验过程水浴温度即使设定为55℃，但温度往往不稳定，容易超过55℃，导致较多目的蛋白被去除，故建议温度设为50℃，30min。既能有效去除已结合的抗体，又能保护目的蛋白。抗体洗脱时膜一定要完全泡在抗体洗脱液中（可用较硬的塑料膜封好），然后将塑料膜完全浸入水中使其受热均匀，否则导致显影出来的总蛋白不均一，影响结果分析。
好了，就讲到这里，后面我们来聊聊为什么有些同学的WB图不尽人意，如何规避，以及内参选择的一些门道。
别忘了点赞、转发、关注，我是老熊，下一篇推文见！
参考文献
[1] Hirano S. Western blot analysis. Methods Mol Biol. 2012;926:87-97.
[2] 林秋雄, 吴炳义. 生物医学基础研究使用手册[M]. 人民卫生出版社, 2021
[3] 陶永光. 肿瘤分子生物学与细胞生物学实验手册[M]. 湖南科学技术出版社, 2014.

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负责重要细胞功能的蛋白质分别使用激酶诱导的磷酸化和磷酸酶诱导的去磷酸化来激活和失活。多种疾病是由激酶和磷酸酶活性的失调引起的。在癌症和神经退行性疾病中已经报道了各种激酶异常。因此，蛋白质磷酸化的分析是一个重要的研究领域，可以确定各种疾病的原因，并有助于激酶抑制剂（分子靶向药物）的开发。
现已已经开发出Phos-tag进行蛋白质磷酸化分析的技术，Phos-tag是一种专门捕获磷酸基团的功能分子。

Phos-tag SDS-PAGE是一种磷酸亲和电泳技术，可使用常规SDS-PAGE程序分离磷酸化和非磷酸化蛋白质。该技术使用分离凝胶，其中丙烯酰胺与作为磷酸捕获分子的Phos-tag Acrylamide共聚。试剂、蛋白质样品制备和电泳操作与常规SDS-PAGE程序相似。由于磷酸化蛋白质在电泳过程中与固定在凝胶中的Phos-tag表现出可逆结合，因此它们的迁移速度比非磷酸化蛋白质的迁移速度更慢，从而导致磷酸化蛋白质的迁移率存在可检测的差异。




这种电泳技术允许分离含有相同数量磷酸基团的磷酸化蛋白质，但在分子内的不同位置会产生不同的迁移带。因此，可以将单一蛋白质的多种磷酸化形式检测为凝胶上的多个迁移带。此外，Phos-tag SDS-PAGE不仅可以分析Ser-、Thr-和 Tyr-磷酸化蛋白，还可以分析参与双组分信号系统的不稳定His-和 Asp-磷酸化蛋白。因此，该技术适用于对具有不同磷酸化状态的蛋白质进行定量和定性分析。由于Phos-tag SDS-PAGE预制凝胶（SuperSep Phos-tag 系列）的商业可用性，该技术可以很容易地应用于多项研究。磷酸化蛋白的条带图像可在Phos-tag SDS-PAGE数据收集中获得。
实验方法
1、配SDS-PAGE电泳凝胶
将1.5mm规格的厚薄玻璃清洗干净后使用双蒸水进行冲洗，待玻璃完全晾干后装入配胶装置。按下表配置好12% Mn2+-Phos tag分离胶，充分颠倒混匀后迅速加入玻璃板间隙中，滴加无水乙醇进行压胶，置于室温中待其凝固。配置5%浓缩胶，待分离胶完全凝固后将无水乙醇倒掉，向玻璃板间隙内迅速加入浓缩胶并插入加样梳（避免气泡产生）待其凝固。
1）12% Mn2+-Phos tag分离胶配制




2）5%浓缩胶配制




2、加样
将已配制的玻璃胶板装置于电泳槽中观察是否漏液，向电泳槽内加入电泳液，随后缓慢拔出加样梳。从冰箱中取出所需的蛋白样品以及蛋白Marker，将蛋白样品放置于100℃金属浴中10 min，4℃，12000rpm，离心5min。按顺序依次上样，并使用2×loading buffer予以配平并记录。

3、电泳
将电压调至50mA恒流下电泳约4 h，直至样品跑至分离胶底部时可结束电泳。

4、洗涤
电泳结束后将凝胶浸泡在含10mmol/L EDTA的1×转膜液中轻轻晃动10min，此过程重复3次。然后将凝胶浸泡在不含EDTA的1×转膜液中再次轻轻晃动10min，以充分去除凝胶中所含有的Mn2+，从而使蛋白更有效地由凝胶转移至PVDF膜上。

5、转膜
将黑色海绵及厚滤纸浸泡于转膜液中，同时将PVDF膜置于甲醇中浸泡使膜得以激活。从电泳槽中取出玻璃胶板，撬开玻璃板后切除上层浓缩胶，将凝胶置于转膜液中，将已激活的PVDF膜放在凝胶上，需避免凝胶与PVDF膜之间产生气泡。夹紧转膜夹后装入电泳槽内，放置于4℃冰箱中，将电压调至50V转膜过夜。

6、封闭
转膜结束后使用TBST清洗PVDF膜，将PVDF膜浸入配置好的5%BSA封闭液中，放置于室温下在摇床上封闭1h。

7、抗体杂交
1）一抗孵育：使用TBST清洗已封闭的PVDF膜两遍，将PVDF膜放置于一抗稀释液中，放于4℃冰箱摇床上孵育过夜。一抗孵育结束后于冰上回收一抗稀释液，PVDF膜用TBST清洗三次。
2）二抗孵育：将PVDF膜放置于二抗稀释液中，放置于室温摇床上，温和孵育2h之后再次使用TBST清洗三次。

8、显影成像
ECL 发光液均匀滴于PVDF膜上，使用凝胶成像仪显影、拍照并分析结果。

同花顺

如果检测了某个蛋白的磷酸化和非磷酸化形式，那说明磷酸化才是检测的主要目标，非磷酸化只是辅助定量。具体可以参考一下转录后修饰PTM，磷酸化只是PTM的一种形式，大多数情况下蛋白磷酸化后改变了通过磷脂膜的能力，所以表现为入核能力的改变（多见于转录因子）；也有另算化后被泛素系统识别导致降解的。每个蛋白的PTM种类和功能是多种多样的，不同位点的不同修饰会带来不同的结果。可以针对性地多参考一下相关的文献