【学习笔记】治疗用蛋白理化分析表征用工具酶总结

病理医师

治疗性抗体、融合蛋白等结构复杂，异质性高，在生产过程中需要严格监管和控制。为了确保单克隆抗体及其他生物分子药物的安全性和有效性，需要对这些药物进行全面深入的表征分析。
治疗性抗体、融合蛋白等的表征通常从三个水平进行，包括自上而下的完整分子量水平、自下而上的多肽水平、亚基水平。常用作治疗性蛋白理化分析的工具酶有PNGase F酶、IdeS酶、Papain、GinsKHAN、GlySERIAS酶、肽图分析用的Trypsin、GluC、LysC、Chymotrypsin等。
PNGase F酶



PNGase F脱糖酶本质上是一种酰胺水解酶，可以作用于天冬酰胺与N-glycan形成的酰胺键而将N-glycan释放，得到脱糖蛋白和游离N-glycan。因此，PNGase F酶可以用于脱糖完整分子量分析和糖谱分析。脱糖完整分子量可以降低因为糖基化修饰带来的异质性，更好的确认蛋白的氨基酸序列是否正确以及方便发现其他可能的修饰。需要注意的是，该酶不能水解岩藻糖连键为α（1-3）的N-glycan，而PNGase A可以完成酶切。含α（1-3）的N-glycan多见于植物表达糖蛋白。
IdeS酶
该工具酶的用途在之前的一篇文献阅读中已经总结（文献阅读002|IdeS工具酶在抗体及Fc融合蛋白分析表征中的应用），不再赘述。


Papain&GinsKHAN


IdeS酶好用，但是对于非常规的抗体或者突变了铰链区的蛋白就束手无策了，这个时候可以尝试使用Papain或GinsKHAN酶进行表征。
Papain酶可以酶切铰链区上方H的C端，得到Fc及两个Fab区域。该酶是双抗配对正确与否表征的一个比较好的工具。而且，这种酶价格非常便宜。不过，Papain特异性较差，在使用该酶时需要使用严格的酶切条件。
针对Papain特异性差的问题，Genovis推出了一种特异性强的铰链区上方酶切蛋白，即GinsKHAN（Genovis没有给广告费哈）。这种酶可以特异性的酶切铰链区上方的K，也是得到Fc和两个Fab。特异性强带来的是这种酶价格昂贵，2000u需要五六千块钱，实在是用不起，还是用我的Papain吧。

GlySERIAS酶



GlySERIAS是一种特异性酶切G4S柔性Linker或PolyG的酶，可以用于表征多功能蛋白结构域的融合蛋白。最近做的一个项目就使用了该酶进行表征，用来推测linker两端的蛋白结构域的翻译后修饰。这个酶比GinsKHAN还贵，2000u一万多块钱，用的我肉疼。

肽图分析用酶
肽图分析是根据蛋白质分子量大小及氨基酸组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶作用于特定的位点将蛋白裂解成多个小片段，通过一些分离手段形成特征性指纹图谱，是治疗性抗体及融合蛋白等一级结构鉴定的“金标准”方法。
下表中列出了常见肽图分析用酶的酶切位点及优缺点，供参考。


参考文献：
1.Collins M, Khalili H. Soluble Papain to Digest Monoclonal Antibodies; Time and Cost-Effective Method to Obtain Fab Fragment. Bioengineering (Basel). 2022 May 12;9(5):209. doi: 10.3390/bioengineering9050209. PMID: 35621487; PMCID: PMC9137653.
2. https://www.genovis.com/

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