ELISA实验用到的试剂器材有哪些？

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ELISA实验用到的试剂器材有哪些？
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细胞培养 Cell Culture
● 细胞培养是指细胞在体外的培养技术，即在无菌条件下，从机体中取出组织或细胞，模拟机体内正常生理状态下的基本生存条件，让它在培养皿中继续生存、生长和繁殖的方法。通过细胞培养，我们可以获得大量性状相同的细胞，以便研究细胞的形态结构、化学组成、功能及机制。在生物实验中，细胞培养周期往往比哺乳动物短，因此，细胞培养是一种更为便捷的体外验证方法。
今天就带大家了解一下哺乳动物的细胞培养过程，及ELISA实验中细胞样本的收集与处理方法。
1.培养基

一般细胞都可以在培养瓶中使用液体培养基培养，但是，某些细胞需要在胶原蛋白等特殊基质上培养，以促进细胞附着、分化或生长，建议查阅相关文献，或咨询细胞类产品的技术支持，以获得您正在培养的细胞的进一步信息。
常用的液体培养基可分为基础培养基和完全培养基：
基础培养基（无血清培养基）：在平衡盐溶液中添加氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。
完全培养基：由基础培养基和添加剂（如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子）组成。

胎牛血清Fetal Bovine Serum
胎牛血清是完全培养基最常用的添加成分。虽然胎牛血清中含有很多支持细胞生长的活性物质，但同时也给细胞培养及分泌物检测造成了诸多不利。例如，检测细胞上清中的TGF-β1含量时，胎牛血清中含有的高浓度潜隐TGF-β1，会对结果造成干扰。为了获得有效的实验结果，需要设立适当的对照，确定TGF-β1的基准浓度。

小贴士
●培养基中添加酚红，便于实时监测pH值。随着孵育时间的增加，pH值范围8→6，培养基会由红色变为黄色。



Fig 1. 培养基颜色变化

2.毒性实验

细胞体外实验通常先进行细胞毒性实验，通过检测药物本身对细胞存活率的影响，来初步摸索药物浓度使用情况。最常用的细胞毒性测试方法是CCK-8法。
以下图为例，不同材料对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞的增殖影响不一：




Fig 2. Relative growth rate of MC3T3-E1 on the substrate and MAO coated samples[1]

注意
毒性药物在浓度过高的情况下，会破坏细胞渗透压平衡，从而导致细胞死亡，并非药物本身的作用。因此，在浓度选取上需格外谨慎。
3.刺激与干预

在体外对细胞进行刺激和干预，会发生多种生理反应，造成大量信号通路及蛋白质水平的变化。细胞实验中，这一步十分关键，因为生物学实验本身的重复性较差，建议结合实验室现有条件，摸索其中变量的改变。
文献中常用的变量有药物（毒物）、营养、酸碱度、氧含量、渗透压、光照、放射、应力、机械损伤、电磁、温度、基因敲除与转染、细菌、病毒等等。

4.样本收集处理

细胞上清
需保证各组间培养细胞的数量基本一致，细胞生长状态良好。建议采用6孔板培养细胞，并保证细胞数量达到10^6左右，即细胞密度达70%-80%左右，即可收集培养液，于2-8℃、1000×g离心20 min，除去杂质及细胞碎片，取上清检测。
细胞裂解液

贴壁细胞用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5 min后收集细胞；悬浮细胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS洗涤3次。每106个细胞中加入150-200 μL PBS重悬（推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂；若含量很低，可减少PBS的体积），并通过反复冻融或超声，使细胞破碎。将提取液于2-8℃、1500×g离心10 min，取上清检测。

■ 反复冻融：-80℃放置1 h/液氮放置0.5 h，然后置于30℃水浴锅中，轻微振荡，使其迅速融化，此操作反复2-3次即可。
■ 超声方法：用超声波发生器，以振幅14 μm超声处理30 s，在冰水浴条件下，破碎细胞；或者使用超声波破碎仪，200 W，2 s/次，间隙3 s，总时间5 min。
样本中建议提前加入蛋白酶抑制剂，常规推荐PMSF：工作浓度:17~174 μg/mL(0.1~1 mM)。

细胞培养过程中，有许多条件需要摸索，包括细胞类型、培养基组分、细胞数量、生产状态、干预条件和物质等。前期基础打得牢固，对后续ELISA或其他种类实验的开展，及结果的分析，具有更多的参考意义。
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参考文献
[1] Chen Y, Dou J, Pang Z, et al. Ag-containing antibacterial self-healing micro-arc oxidation coatings on Mg–Zn–Sr alloys[J]. Surface Engineering, 2021, 37(7): 926-941.

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一、简介
酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA或ELASA）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。
基本原理：
①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。
②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
③用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。
④加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
二、ELISA主要材料试剂
1.抗原和抗体
在ELISA实验过程中，抗原和抗体的质量是决定实验是否成功的关键因素。本法要求所用抗原纯度高，抗体效价高、亲和力强。ELISA所用抗原有三个来源：天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原。
天然抗原取材于动物组织或体液、微生物培养物等，一般含有多种抗原成分，需经纯化，提取出特定的抗原成分后才可应用，因此也称提纯抗原（purified-anigen）。
重组抗原（recombin-antantigen）和多肽抗原（peptide-antigen）均为人工合成品，使用安全，而且纯度高，干扰物质少。因此虽然制备合成抗原有较高的技术难度且要求较为昂贵的仪器设备和试剂，但对那些不易得到的天然抗原，显出其独特的优势。
用于ELISA的抗体有多克隆抗体和单克隆抗体。富含多克隆抗体的抗血清成分复杂，应从中提取IgG才可用于包被固相或酶标记。含单克隆抗体的小鼠腹水中的特异性抗体含量较高，有时可适当稀释后直接进行包被。制备酶结合物用的抗体的质量往往要求有较高的纯度。提纯时可采用硫酸铵盐析IgG后，用分子筛层析提纯，也可用直接使用亲和层析法提纯IgG，此外如果使用酶消化IgG后再提取Fab片段，则效果会更好。
2.ELISA板
可用作ELISA板的物质很多，最常用的是聚苯乙烯和聚氯乙烯，它们具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后保留原来的免疫活性。作为塑料，可制成各种形式。在ELISA测定过程中，它们作为载体和容器，不参与化学反应。加之它们的价格低廉，所以被普遍采用。专用于ELISA测定的产品也称为ELISA板，国际通用的标准板形是8×12的96孔式。
良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间和同一板各孔之间性能相近。

队长是我

试剂器材
一、试剂
(1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):NaHCO3 2.93克 加蒸馏水至1000ml
(2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 NaCl 8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸馏水至1000ml
(3) 稀释液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1克 加洗涤缓冲液至100ml 或以羊血清、兔血清等 血清与洗涤液配成5～10%使用。
(4) 终止液(2M H2SO4）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98%)21.7ml。
(5) 底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸):0.2M Na2HPO4(28.4克/L) 25.7ml 0.1M 柠檬酸(19.2克/L) 24.3ml 加蒸馏水50ml。
(6) TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg/5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml 0.75% H2O232μl
(7) ABTS使用液:ABTS 0.5mg 底物缓冲液(PH5.5) 1ml 3% H2O2 2μl
(8) 抗原、抗体和酶标记抗体。
(9) 正常人血清和阳性对照血清。
二、 器材:
(1) 聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。
(2) 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。
(3) 4℃冰箱，37℃孵育箱。
三、 注意事项
1. 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。
2. 在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:
(1) 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
(2) 包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值大而蛋白量少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。
(3) 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
(4) 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。