汇总 | 流式常用的免疫细胞标记物

虎威将军

免疫力源自免疫系统，对外抵抗病原体入侵，对内清除受损和变异细胞，起防御、监视和保护作用。
对免疫系统的破译，疾病相关免疫机制的研究，疫苗、抗体药物及免疫疗法的开发，都是免疫学研究进展和应用价值的体现。其中，流式细胞术的出现，极大地促进了免疫学的发展。
今天就讲讲流式细胞术常用的免疫细胞标记物们。
免疫细胞分型的最佳标志物（人/小鼠）以及常见各免疫细胞亚群的百分比excel版资料有需要可以自行下载！


一、流式细胞术发展概要

1934年Andrew Moldavan试图用光电探测器分析流过一根毛细管的单个细胞，提出被广泛认为是流式细胞仪最早原型的设计观念，此后流式细胞术经过早期演变，在20世纪60年代后期和70年代快速发展了起来。
1975年，George Kohler和Cesar Milstein提出了单克隆抗体技术。在此基础上，生物学研究人员开始制造针对白细胞的单克隆抗体，获得了一系列能产生靶向白细胞表面分化抗原的单克隆抗体的克隆，并用荧光染料标记抗体，为流式细胞研究中大量特异性的免疫试剂的应用奠定了基础。
这其中的许多克隆被沿用至今，由它们产生的高质量流式抗体被广泛用于生命科学的基础研究，以及一些疾病的临床诊断，尤其是白血病的诊断和分型。
有意思的是，早期单克隆抗体的出现促进了流式在免疫学中的应用，而近年来，流式又被越来越多地应用于单克隆抗体的研发和生产中。
流式具有快速、高通量的特点，相比于WB能在更短的时间分析出同一样品中的多个靶点表达情况，结合细胞表型标记物可以对特定的细胞群和亚群进行分析。因此在免疫学研究中具有不可比拟的优势。
<hr/>二、免疫细胞及常用标记物

免疫系统包括免疫器官、免疫细胞和免疫分子，其中免疫细胞是免疫系统具体功能的主要执行者。根据免疫应答的类型，分为固有免疫细胞和适应性免疫应答细胞。
固有免疫细胞包括巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞、NKT细胞、固有淋巴样细胞、粒细胞、肥大细胞等。
适应性免疫应答参与的细胞主要则是表达特异性抗原识别受体（TCR/BCR）的T和B细胞。
免疫细胞标记物被广泛用于流式检测中鉴别和区分不同类型的免疫细胞，下面就给大家介绍一下常见的免疫细胞以及其流式检测常用标记物。



常见免疫细胞流式检测常用标记物

<hr/>1）Leukocyte common antigen

CD45也被称为白细胞共同抗原（leukocyte common antigen, LCA），表达于除红细胞和血小板以外的所有造血细胞及其各分化亚群上，是常用的造血细胞标志物。

Tips：人CD45存在由编码胞外域的第4、5、6号外显子选择性剪切而产生的多种异构体，不同异构体的表达具有细胞类型的特异性，并取决于细胞活化和分化的状态，例如CD45RA在幼稚T细胞上表达，活化和记忆T细胞表达CD45RO。CD45的抗体包括名称分别为CD45、CD45RA、CD45RB、CD45RO、CD45R的不同抗体。

Tips：小鼠CD45的等位变异CD45.1和CD45.2分别表达于不同的小鼠谱系，多数小鼠谱系表达CD45.2（如BALB/c、C57BL小鼠），而CD45.1只在少数小鼠谱系（如SJL/J）中表达。CD45.1和CD45.2常被用于追踪骨髓移植后小鼠造血细胞的来源。

<hr/>2）Haematopoietic stem cells

造血干细胞是具有高度自我更新能力和多能分化潜能的造血前体细胞，血细胞均由造血干细胞分化而来。
人造血干细胞的主要表面标志物为CD34、CD90、CD117，不表达CD38、CD45RA及各种成熟血细胞谱系相关的表面标志。
小鼠造血干细胞的主要表面标志物包括Sca-1、CD117。

Tips：由造血干细胞分化成的血液细胞，除去红细胞和血小板外的细胞为白细胞，淋巴细胞包括T细胞、B细胞和NK细胞，粒细胞包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，外周血单个核细胞（PBMC，或无颗粒白细胞）不包含粒细胞。如果流式实验的研究对象是白细胞，通常采取用红细胞裂解液裂解血液中的红细胞；如果研究对象是PBMC，常用Ficoll密度梯度离心分离PBMC。

<hr/>B cells>>>>
B细胞和T细胞是适应性免疫的组成部分，表达特异性抗原识别受体（BCR/TCR），分别发挥细胞免疫和体液免疫效应。B细胞也是重要的抗原提呈细胞，并参与免疫调节。CD19和CD20是常用的pan-B细胞标记物。CD45R（B220）在小鼠B谱系细胞上表达（浆细胞除外），通常用做小鼠pan-B细胞标记物。
T cells>>>>
T细胞来源于造血干细胞，在胸腺中发育成熟，介导适应性免疫中的细胞免疫应答。CD3是常用的pan-T细胞标记物。
T细胞根据功能特性可以主要分为辅助性T细胞、细胞毒性T细胞和调节性T细胞；根据TCR的类型可分为αβT细胞和γδT细胞；根据CD4和CD8的表达可分为CD4+T细胞和CD8+T细胞，它们又可以分为不同的亚群；根据所处的活化阶段可以分为初始T细胞、效应T细胞和记忆性T细胞，CD45RA和CD45RO分别是人初始T细胞和记忆性T细胞的重要表型。

Tips：CD3是检测T细胞最常用的标记物。CD3最早出现在前胸腺细胞的胞浆中，随着T细胞的成熟，胞浆CD3逐渐丧失，而出现在细胞膜上。某些克隆（如OKT3、HIT3a、UCHT1、145-2C11）的CD3抗体可以用于活化T细胞。

CD4和CD8分别是辅助T细胞和细胞毒性T细胞标记物，但除T细胞和胸腺细胞外，CD4和CD8也表达于其他免疫细胞类型，CD4可表达于单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞，CD8可表达于NK细胞和树突状细胞。
<hr/>3）Dendritic cells

树突状细胞是一类成熟时具有许多树突样突起的专职抗原提呈细胞，能识别、摄取和加工抗原并将抗原肽提呈给T细胞。树突状细胞不仅参与固有免疫，也是连接固有免疫是适应性免疫的桥梁。树突状细胞主要分为经典树突状细胞（cDC）和浆细胞样树突状细胞（pDC）。
目前缺乏树突状细胞特异性标记物，可以使用多种标记物存在与否的组合来鉴定树突状细胞。树突状细胞对其它白细胞谱系的标志物（Lineage）呈阴性，例如CD3、CD14、CD19、CD20、CD56，不同的亚群可表达MHC Class II、CD1、CD8a、CD11b、CD11c等相关标志分子。
<hr/>4）Natural killer cells

自然杀伤细胞（NK细胞）是参与固有免疫的重要成员，具有淋巴细胞形态，但不表达特异性抗原识别受体，无须预先致敏就能直接杀伤靶细胞。常用于检测人NK细胞的表面标志物为CD56、CD16，小鼠NK细胞表达NK1.1、CD49b（DX5）。
Tips：T细胞亚群中的NKT细胞与NK细胞在表型和功能上具有一些共同点，NKT细胞表达CD16、CD56、NK1.1、CD49b，并会产生颗粒酶。因而在对血液或组织中的NK细胞进行分型时需要加上CD3做阴性选择排除T细胞。
来源于PK136克隆的NK1.1抗体识别某些小鼠品系（如C57BL、NZB）中CD161上的一个特定表位，常用于检测小鼠NK细胞，但在有些小鼠品系（如AKR、BALB/c、CBA、C3H、DBA）中则不适用。
<hr/>5）Monocytes

单核细胞起源于骨髓中造血干细胞的髓系细胞。骨髓髓样干细胞在M-CSF及单核细胞生长因子的刺激的下发育成前单核细胞，前单核细胞发育成单核细胞并不断进入血液。
CD14被视为相对特异性的单核细胞标记物，CD14high CD16-人单核细胞被认为是经典单核细胞，而CD14+ CD16+细胞为非经典单核细胞，CD11b, Ly-6G（Gr-1）常用作小鼠单核细胞标记物。
<hr/>6）Macrophages

巨噬细胞广泛分布于各种组织，根据组织定位和功能，可以将巨噬细胞分为肝脏Kupffer细胞、小胶质细胞、肺泡巨噬细胞、肾脏系膜细胞、破骨细胞、脾脏红髓巨噬细胞、脂肪组织相关巨噬细胞等等。
巨噬细胞执行吞噬功能，并广泛参与抗感染、抗肿瘤、免疫应答和免疫调节等。根据活化状态、功能及分泌细胞因子的不同，巨噬细胞主要可分为经典活化的M1型巨噬细胞和选择性活化的M2型巨噬细胞。
常用的巨噬细胞标记物包括CD11b、CD14、CD16、CD68、F4/80（小鼠），CD80和CD86为常用的M1型巨噬细胞标记物，CD163和CD206为常用的M2型巨噬细胞标记物。

Tips：CD68主要表达于巨噬细胞的晚期内体和溶酶体，使用CD68抗体检测巨噬细胞需要按照胞内抗原的检测方法对细胞进行固定和通透。

<hr/>7）Megakaryocytes/platelets

巨核细胞是在骨髓中由造血干细胞分化而来、能产生血小板的细胞。血小板的主要功能是凝血，此外还参与免疫应答和炎症反应。
巨核细胞/血小板的标记物有CD9、CD31、CD41、CD42b、CD51、CD61、CD62P。
<hr/>8）Granulocytes

粒细胞起源于骨髓中的造血干细胞，由于核的形状不同，它们也被称为多形核白细胞。根据苏木精和伊红的染色特征分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞三类。
CD11b、CD16可用作人中性粒细胞标记物，CD11b、Ly6G作为小鼠中性粒细胞标记物。CD13、CD107a、CD107b是嗜碱细胞激活标记物。
<hr/>9）Red blood cells

红细胞也称红血球，血液中数量最多的一种血细胞，运输氧和二氧化碳，同时也具有免疫功能。
CD235a为红细胞表面唾液酸糖蛋白，表达于红系前体细胞和红细胞。TER-119是一种小鼠红细胞谱系特异性单克隆抗体，可与从早期成红血细胞到成熟红细胞的各分化阶段的红细胞反应。
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