对照设计的好不好，直接决定流式实验的成败！

生物科研实验室

在流式细胞术中，设置合理的对照组是确保实验成功的关键。流式细胞术中的对照类型丰富多样，至少包括六种：空白对照、同型对照、单染/单阳对照、荧光减一对照、死活对照和生物学对照。这些对照的主要目的是规避实验中的假阳性或假阴性结果，从而获取高质量的实验数据。
一、空白对照（Blank Control）
空白对照用于界定阴性细胞群、评估细胞大小及颗粒度。通过空白对照，我们可以有效区分细胞的背景荧光与本底自发荧光，同时排除实验处理过程中可能引入的荧光干扰，进而避免假阳性结果的出现。
在实验中，空白对照常被用来调节FSC（前向散射）和SSC（侧向散射），特别是在荧光通道中，它作为调节电压的辅助手段，有助于我们观察到细胞的本底信号，并在圈门时直接将其排除。
二、同型对照（Isotype Control）
同型对照是真正的阴性对照，它采用与检测抗体种属来源相同、免疫球蛋白亚型相同、使用剂量和浓度相同、偶联荧光素也相同的抗体，但这些抗体不与目的抗原发生特异性反应。同型对照的主要作用是区分抗体非特异性结合到细胞上所产生的背景荧光。
1、为什么要用同型对照？
在正常情况下，抗体的Fab段会与目标抗原发生特异性结合。然而，白细胞（如B细胞、NK细胞等）表面表达多种Fc受体，这些受体可能与抗体的Fc端发生非特异性结合。通过使用同型对照抗体，我们可以有效减少这种非特异性结合带来的干扰，从而获得更准确的实验结果。
2、如何选择同型对照？
选择同型对照时，应确保对照抗体与流式抗体的同种属和同亚型相匹配，如Mouse IgM、Rabbit IgG等。同时，对照抗体应采用与检测抗体相同的荧光标记，如FITC、APC、PE、ABflo®488等。
三、单染/单阳对照（Single Staining Control）
在多色流式细胞术实验中，由于不同荧光素之间可能存在光谱重叠，这会对实验结果产生干扰。因此，我们需要设置单染/单阳对照，以显示不同荧光素之间的重叠水平，并进行补偿调节，从而去除这种重叠干扰。此外，单染/单阳对照还可以辅助调节通道电压，防止信号超出接收范围，影响结果的判定。
单染/单阳对照是指仅染一种荧光染料的对照管。在多色panel实验中，panel中有几种颜色，就需要设置几个单染对照管。例如，在PE、ABflo®647、ABflo®700、ABflo®488的4色panel中，我们需要设置4个单染/单阳对照。
四、荧光减一对照（Fluorescence Minus One Control）
荧光减一对照是指在样本中去除一个荧光素抗体，即样本中添加了除了目标荧光抗体外的所有荧光抗体。例如，在PE、ABflo®647、ABflo®700、ABflo®488的4色panel中，如果去除PE荧光抗体染色，则称为PE-FMO。通过减少一个通道的荧光信号，我们可以衡量其他通道的荧光溢漏情况，从而评估荧光染料的相互干扰和补偿本底。荧光减一对照是多色实验设门所必需的对照。
另一方面，荧光减一对照还可以作为某些指标的阴性对照，用来排除全染的背景影响，使圈门更为准确。以常见的人PBMC B细胞荧光减一对照染色为例，结果显示CD19-ABflo®647-FMO、CD3-PE-FMO、7-AAD-FMO对照组染色后，阴、阳性细胞群分群清晰，可准确区分阳性、阴性细胞群。
五、死活对照
死细胞具有更大的自发荧光，这容易导至假阳性结果的出现，从而对实验结果产生极大影响。虽然通过FSC和SSC可以帮助清除部分碎片和死细胞，但无法将其全部移除。因此，我们需要使用鉴定死细胞的活性染料（如PI、7-AAD等）进行死活染色，以去除死细胞对实验结果的干扰。
以TBNK全染组染色为例，通过FSC-A/H圈出淋巴细胞并排除黏连细胞后，利用7-AAD染色圈除死细胞。接着用CD45圈出白细胞，再对淋巴细胞群体进行进一步分析。通过CD3圈出T细胞后，对非T细胞群进行进一步分析；最后利用CD19圈出B细胞，CD56圈出NK细胞。结果显示，在多色实验中CD3+T细胞、CD3-CD19+B细胞、CD3-CD19-CD56+NK细胞分群清晰。
六、生物学对照（Biological Control）
生物学对照是指除研究对象外，其他条件均保持一致的对照实验组。它用于确定染色的特异性和实验结果的可靠性。例如，在检测样本受刺激后抗原表达量变化时，我们应以未刺激样本作为对照。以HUVEC内皮细胞中CD62E表达情况检测为例，正常内皮细胞不表达CD62E，但当内皮细胞受到炎症因子（如TNF-α）的刺激时，CD62E的表达量会增加。通过对比刺激前后CD62E的表达情况，我们可以评估刺激对内皮细胞的影响。