生化 | 一文读懂单色仪及其在光谱仪中的作用

John

光谱仪是研究许多生物和化学过程及物质的重要工具，从色素到植物生长，从核酸到药物，根据其光学特性提供有关分析物的信息。光谱仪本质上是一种将光分离成特定波长的机器，然后使用阵列检测器[1]，如电荷耦合器件（CCD）[2]进行检测和立即记录。光谱仪的第一个处理步骤是分离进入的光线，这是由单色仪来完成的。
本文介绍了什么是单色仪，它是如何工作的，不同类型的单色仪，单色仪的用途以及它们在光谱仪中的作用。
什么是单色仪？
单色仪是一种从特定光源中分离出不同波长的光的装置。其主要部件通常包括一个入口狭缝、镜子和一个光散射器[3]。棱镜或光栅通常被用作光散射器[3]。大多数单色仪都有一个出口狭缝，分离出来的光在这里离开设备，但是光谱仪中使用的单色仪有一个阵列检测器，通常是CCD，取代了出口狭缝，以一次采集一系列波长的数据，从而得到实时数据[2]。
单色仪是如何工作的？
当光线以平行方向行进时，通常被称为准直光，当它们处于这种形式时，光线可以被控制[3]。在单色仪中，进入的光线通常使用镜子进行准直，分散并瞄准检测器。有不同的方法来实现这种设置，这超出了本文的范围，但在这里我们将集中讨论最常见的形式，即所谓的Czerny-Turner排列（图1）。


图1 | Czerny-Turner单色仪的示意图，显示了其组成部分和从光源到检测的光的路径。
在Czerny-Turner排列中，有两个凹面镜和一个衍射光栅。光线进入单色仪的入口狭缝（图1B），然后到达第一个凹面镜（图1C），凹面镜将光线排列整齐，使它们平行地移动。然后，平行的光线到达衍射光栅，它将不同波长的光线弯曲成不同的角度（图1D）。然后光线到达第二个凹面镜，将不同波长的光线聚焦在不同的位置（图1E）。旋转光栅（图1D）可以控制随后传到CCD探测器（图1F）的光的波长范围[3]。
在比色分析中用于进行吸光度测量的光学仪器通常有一个单色仪。然而，为了实现更准确的高吸光度测量，在一台仪器中拥有多个单色仪的做法正变得越来越普遍。双单色仪的设置通常用于高质量的分光光度计，其中两个单色仪串联运行，串联排列（图2A）。使用双单色仪的安排可以提高分辨率[6-8]，但会导致到达检测器的光强度变弱。离开第一个单色仪的光进入第二个单色仪，以帮助去除不需要的波长的光，通常称为杂散光。


图2 | （A）、（B）和（C）分别代表了一个不同的光谱仪设计。双重单色仪安排的示意图（A）与使用单一单色仪相比，已知可以提高分辨率并大大减少杂散光[7, 8]。典型的四重单色仪配置（B）包括一对双单色仪，通常用于高分辨率的荧光研究，以及用于荧光分析的常见双单色仪配置（C）。彩色箭头从概念上说明了光的分离，从光源的彩虹箭头开始，然后在每次通过单色仪后提取特定波长的光。请注意，本图中表示的MC是单色仪的缩写。假设是使用光谱仪设计检查样品，其中（A）是典型的吸光度测量，（B）和（C）设计用于荧光。
一些杂散光总是可以预料到的，可能来自单色仪内不希望发生的衍射或散射，或来自环境，如果光学设备没有完全密封。在测量非常高的吸光度值或样品中非常微弱的荧光发射时，杂散光是有问题的，因为到达检测器的大部分光线都是杂散光[3]。
一个普通的单色仪可以被改造成双色器[6]或多色器[7-9]。简而言之，单色仪的构造是这样的：在到达检测器之前，使用一对相互成直角的镜子将光反射回光散射器[6,7,9]。如果光被分散两次，类似于将光通过单色仪两次，那么它的行为就像一个双单色仪。同样的方法也被用来有效地模仿四重单色仪，在这里，光要通过四次散光器，从而获得更好的分辨率和更少的杂散光[7]。
从技术上讲，四重单色仪可以让光通过同一个单色仪四次[7]，其行为类似于让光通过四个串联排列的单色仪，但这并不是这个术语的典型含义。四重单色仪通常是指利用两个双单色仪的设置，在荧光研究中很受欢迎（图2B）。在这种安排中，首先用一个双单色仪选择一个狭窄的波长范围来激发荧光样品，然后用另一个双单色仪来选择光的发射波长范围。由于荧光样品发出的微弱光强与杂散光的光强相竞争，因此减少荧光研究中的杂散光是必须的。
有时，双单色仪可能被称为双单色仪系统，但双单色仪系统通常不是双单色仪。例如，一种被称为荧光计的测量荧光的光学仪器有两个单色仪：一个用于选择激发或吸收波长，另一个单独用于选择发射波长（图2C）。
单色仪的类型
不同类型的单色仪可以根据光在其内部的分散方式进行分类，其中棱镜和光栅是最常见的。
棱镜单色仪
顾名思义，棱镜单色仪使用棱镜来分散光线。棱镜依靠的是折射率的差异，这意味着当光穿过棱镜材料时，其速度会发生变化。因此，白光的颜色将被相应地分割。例如，蓝光在玻璃棱镜中比红光更慢、更弯曲。
棱镜有时可能本身就有某些材料的缺点。例如，氯化钠或氯化钾制成的棱镜材料可用于红外光谱分析[10]，但由于吸收空气中的水分，两者的棱镜性能会随着时间的推移而退化。用于红外分析的蓝宝石棱镜[10]将是一个更好的替代品，但一般都很昂贵。
另一个例子是，玻璃棱镜不能用于检查紫外线（UV）范围内的波长，因为玻璃会吸收紫外线[10]。相反，需要用石英棱镜来检查紫外线光谱[10]。
棱镜单色仪在紫外范围内工作时通常是首选，但实际上今天大多数单色仪使用光栅。
光栅单色仪，包括Czerny-Turner单色仪
迄今为止，光栅是单色仪中最常用的分散元件。一个单色仪中可以包括几个光栅，在一个仪器中的不同波长范围内提供不同的选择性。这是很有用的，因为每个光栅通常对特定的波长范围和某些应用效果最好。
光栅是一种有规则的、均匀分布的沟槽的光学元件，通常在另一种材料的上面有反射涂层。到达光栅的光线可能以不同的角度被反射，当光线反射时，每个凹槽都作为一个光源[3]。
炽热光栅，也被称为埃切莱特光栅，是一种特殊的专门类型的光栅，被设计为在特定波长的光下运行得最好。用于检查红外线范围（长波长）的光栅，其沟槽之间的间距要宽得多，而用于紫外线范围（短波长）的光栅，其沟槽之间的间距要小得多。
从光栅分散出来的反射光在同相位时可以产生建设性的干涉，在非同相位时可以产生破坏性的干涉，或者在两者之间[3]。破坏性干扰的反射光会降低光强度，这是预料之中的，但所有光栅固有的缺点是干扰会导致顺序重叠。
例如，波长为300 nm的二阶光会与波长为600 nm的一阶光重叠，因此CCD探测器会同时识别这两种波长的光。阶次重叠是不可取的，可以通过添加过滤器、串联的第二个单色仪或附加光栅来消除。
单色仪中的大多数光栅是作为高质量原始光栅的复制品，也称为主光栅[11, 12]。与其直接生产用于单色仪的主光栅，不如用模具制作主光栅的复制品，这样可以大大降低生产成本，简化光栅的大规模生产。
高质量的光栅具有最小的表面缺陷，而这些缺陷会导致杂散光[13]，因此提供高分辨率。传统上，高分辨率的衍射光栅是被统治的，但全息制作的光栅产生的杂散光较少[13]。在讨论衍射光栅的分辨率时，更高或更好的分辨率是指可以区分的光的波长差异变小的情况，意味着更多的细节变得可见[3]。
当光栅中存在更多的沟槽时，分辨率就会提高[3]。例如，低成本项目可以使用光盘（CD）或数字多功能盘（DVD）作为衍射光栅，DVD比CD有更多的凹槽，因此提供更好的分辨率[14]。
众所周知，减少光栅上的沟槽间距可以增加色散（光的波长如何容易分离和扩散）和分辨率[3]。在单色仪中，光栅的平滑旋转预计会产生波长的线性变化。使用光栅时，光的色散是线性的，与棱镜相比，这是一个很大的优势，因为棱镜有非线性的光色散。这反过来又简化了数据处理、分析和解释。
总的来说，光栅单色仪，特别是Czerny-Turner单色仪设计，是最常用的。表1列出了与棱镜单色仪相比的优势和劣势摘要。
表1 | 使用反射式衍射光栅和棱镜来分散单色仪中的光的优缺点比较。

反射式衍射光栅	棱镜
分散方法	衍射法	折射率
透射效率	总体效率较低（由于光线分散到多个方向）	效率高
光照强度低的情况	较差	更好
分散性	线性	非线性
光谱分辨率	总体较好	总体上较差，但在紫外线下较好
温度对色散的影响	低（变形）	高（改变折射率）
阶次重合	有	无
杂散光	较多	较少
重量	较轻	较重
总成本	更少	更多

粗体字的条目更有优势。
单色仪的用途是什么？
单色仪在需要时用于控制光的波长，例如在光谱分析技术中。通常采用单色仪的例子包括：

• 紫外线-可见光（UV-Vis）光谱；
  
• 原子吸收光谱；
  
• 荧光光谱；
  
• 拉曼光谱；
  
• 圆二色光谱。
  

单色仪可能最常被用于紫外-可见光吸收光谱，分析的样品类型包括蛋白质、药品、饮料、DNA和RNA[16]。
分光镜中的单色仪
在决定是使用棱镜还是衍射光栅时，最好牢记具体的应用。如果在低光照情况下需要高信噪比和高灵敏度，那么就应该使用棱镜单色仪。高效率的光传输通常会产生高灵敏度；棱镜的效率通常比衍射光栅高[17]。这对涉及低强度光实验的情况很重要，比如用可见光分光光度法测量深色样品的吸光度，或用荧光法测量微弱荧光的样品。
在绝大多数的现代光谱仪中，单色仪中都有衍射光栅来分散光线。快速吸光度测量有特殊用途，特别是在分析DNA、RNA、药品和染料方面的应用[16]。这些测量通常是使用微孔板阅读器完成的，它可以使用双单色仪光谱仪进行数百或数千次快速测量。此外，微孔板阅读器还可以使用四重单色仪光谱仪进行快速、高分辨率的荧光测量。当需要进行多个快速分光光度测量或分析时，光谱仪是第一选择。
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