免疫荧光自发荧光问题及软件简要处理

虎威将军

做过免疫荧光的同学大概都遇到过自发荧光的问题，一般比较严重的组织，像脾脏，肝脏等血红细胞多的组织较为严重，自发荧光的来源主要是黄素，脂褐素等。由于自发荧光的干扰，有时目的信号难以分析。我们看一个例子：
图1 视野来自小鼠肺脏，两种蛋白分别由488染料绿色，以及647染料粉色标记，注意这里有较多黄色自发荧光，是血红细胞产生。该图片的488染料由长波通滤光片拍摄，所谓长波通，即该波长以上的荧光均被激发，而自发荧光的波长范围很广，从绿色至红色都有，绿色和红色都有的情况下显示为黄色。
如果用窄波通滤光片拍488荧光，则黄色荧光会被拍成绿色，所谓窄波通，即只激发488附近的荧光，因为自发的荧光范围很广，但窄波通只激发自发荧光绿色荧光部分，所以血细胞会被激发为绿色。这样会造成目的信号分辨不清 如图2。
因而，我们在拍照有较多自发荧光的视野时，尽量选择长波通滤光片拍488染料。647染料因为远离自发荧光波长，所以不受影响，背景干净。通常我们提交图1，这种目的清楚，可以有效区分背景和目的信号时，评审是可以接受的。或者使用软件通过简单调整色相，在不改变目的信号表达的情况下，减少自发荧光影响。如图3。



图 1   图2   图3

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