为什么用CRISPR/Cas9进行敲除之后还能检测到表达量呢？

笑看风云

香蕉的基因编辑。图中的E13突变株系为纯合敲除，但是为什么用荧光定量还是有50%的表达量呢？如果将qPCR的引物扩增区域设计在基因突变位点的下游，是不是就不太能检测到表达了呢？求教，十分感谢！





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感恩由您

你的检测方法是关键 首先 qPCR是有很多问题的 不论是引物设计的特异性问题 还是本身的问题 qPCR都不适合于用来评价KO的效果。
大师姐建议在基因水平的Sanger测序和在蛋白水平的WB或者蛋白质组学（没有高质量的单抗下）才是最好的评价方法

卡卡

敲除蛋白，就要检测蛋白。
如果你是敲除RNA，那么你才能检测RNA。
RNA到蛋白这一条链存在一个不可忽视的过程叫翻译。

长长的路

我一直都认为做CRISPR敲除的还检测mRNA水平是个智障行为，不知道是谁开的头，很多文章都这样干，但这个检测是没有意义的。敲除的本质是使翻译移码，造成功能的缺失，和mRNA表达高低没有半毛钱关系

清风寡欲

只要基因的启动子、增强子还保持完整，那么就会产生转录本，转录的速率跟野生型的相同。只是因为CRISPR敲除诱导的移码突变的存在，这些转录本不能产生有功能的蛋白产物，还有可能通过nonsense-mediated mRNA decay途径或者影响内含子剪接导致这些敲除转录本的半衰期较短，因此在qPCR检测中表现为表达量下降。
为了验证你的敲除成功，可以用以下实验方法来提供有信服力的证据。一个是用western blot验证蛋白层面的敲除。但是对于非模式物种很多蛋白都没有抗体，即使有抗体也可能遇到非特异性结合和杂带的困扰。
另一条路是在mRNA水平验证，但是通过巧妙的引物设计来实现目的。把一条引物直接设计在CRISPR敲除区域或者切割位点，这样敲除成功的样品中即使有转录，qPCR也扩增不出相应区域。甚至还有更严谨的做法，就是设计一对跨敲除区域的引物，通过琼脂糖凝胶电泳检测cDNA扩增条带，预期能看到敲除的条带比WT短，缺失的部分长度对应CRISPR敲除的区域。还可以克隆扩增产物进行Sanger测序来弄清楚敲除对基因转录本的影响。
最好还是从根源上消除不确定性，方法就是在设计CRISPR方案的时候，一个gRNA设计在TSS上游的启动子区域，另一个设计在目的基因的一个外显子区域，把从部分启动子的元件，到TSS、第一个外显子、起始密码子、第一个内含子连同其中的下游增强子，第二个外显子，到部分编码序列，通通都给敲除掉，诛九族，连根拔起，保证这个基因绝无活性，qPCR和蛋白水平都能明确无误的检测不出来，绝无模糊空间，绝对不会引起质疑。