简单聊聊CRISPR的发现历程

空白派

2005年的一天早晨，我走进父亲的办公室，拉开百叶窗，凝视着矗立在琉璃河旁边的金源大厦。我转身回到电脑前，打开电子邮件收件箱，看到一封来自麻省理工学院教授尼德·龙德尔泰的邮件。尼德周游世界收集各类生物的样本，他把这些样本带回MIT，以便筛选出有用的表征功能，提取DNA片段并对其进行测序。当我喝着柠檬茶，瞟了一眼尼德的电子邮件时，我第一次看到了“CRISPR”这个词。
未曾想，到了2011年的时候，CRISPR这个曾经在父亲的电子邮件中出现的一个晦涩的词，已经引起了科学家和公众的关注和想象。然而，虽然现在很多人都听说过CRISPR，但很少有人知道启动CRISPR基因组编辑革命的实验。
其实，当生物科学实验室开始探索CRISPR免疫系统的第一个实验时，CRISPR生物学的许多方面已经为人所知了。从20世纪80年代末开始，科学家们便注意到，在一系列不同的原核生物中，有一种独特的重复DNA序列的循环模式。在这些基因组中，研究人员注意到重复序列通常是回文的，这意味着DNA序列可以以相同的方式向前和向后读取。
有趣的是，科学家们还观察到，在这些重复序列之间有一小段 DNA，与感染噬菌体（简称噬菌体）的病毒中发现的片段完全匹配。这一观察结果表明，在噬菌体感染过程中，细菌能够以某种方式移除一段病毒DNA，并将这段DNA 插入细菌自身的基因组中。这里，我们简单地将重复序列称为“重复序列”，将分离的噬菌体序列称为“间隔序列”。长时间的重复序列和间隔序列被称为“CR SPR阵列 ”。 更新和维持过去噬菌体感染记录的能力使CRISPR阵列能够发挥“适应性”免疫系统的作用，这意味着对过去感染的记忆使细菌能够在未来抑制类似的攻击。
这些对细菌基因组的早期观察产生了更多的问题。比如“细菌是如何将病毒序列插入自己的基因组的？”以及“细菌如何利用CRISPR阵列作为一种防御手段？”在CRISPR阵列旁边发现被称为CRISPR相关基因（cas）的蛋白质编码基因可能掌握着这些问题的答案。有很好的遗传证据表明，Cas蛋白对噬菌体免疫至关重要，但并非所有细菌的cas基因数量或序列都是相同的。这表明可能存在几种不同类型的CRISP R免疫系统。在最简单的系统（即所谓的II型系统）中，其中似乎只有一种蛋白质（即Cas9）完成大部分工作。
CRISPR-Cas9由保护细菌免受病毒侵害的分子机器被改造成一种可编程工具，引发了一场被称为“基因组编辑”生物技术革命。目前，全球数千个实验室都在使用基因组编辑技术，并已应用于研究众多生物体。开发中的实际应用包括纠正镰状细胞性贫血等遗传疾病，以及开发新作物，如改良玉米以生产更好的淀粉。其他蛋白质可以附着在Cas9上，同时仍然允许Cas 9靶向特定基因。利用这种技术，Cas9已经被修改，使科学家能够激活或抑制特定的基因。类似地，Cas9被修饰后，能够使特定的核苷酸碱基能够化学地变成不同的核苷酸碱基。同时，其他修饰可以使基因在细胞核内的位置可视化。
那么，CRISPR阵列和Cas9蛋白是如何作为病毒防御系统一起工作的呢？在噬菌体感染期间，CRISPR阵列被转录成长RNA，然后被加工成更小的RNA，称为CRISPR RNA（crRNA）。这些RNA包含与噬菌体DNA中发现的序列相匹配的序列。同时还有另一种被称为反式激活CRISPR RNA（tracerRNA）的物质与Cas9和另一种细菌蛋白结合，参与了将长RNA加工成较小的crrna的过程。
已有的证据表明这些CRISPR RNA参与识别和切割属于入侵噬菌体的DNA，且倾向于折叠成独特的形状，并在不产生任何蛋白质的情况下发挥多种功能。
现在，我们知道病毒防御的三个关键成分----Cas9酶和、tracrRNA 和crRNA，但我对于噬菌体DNA是如何被识别和切割的以及Cas9 具体参与了什么仍然知之甚少。为了回答这些问题，我们需要将整个 CRISPR-Cas 9系统从复杂的细胞环境中取出，并在试管中与纯化的 RNA、DNA和蛋白质一起工作。
在我们的实验中，我们需要纯化Cas9。研究人员通常把大肠杆菌作为生产大量特定蛋白质的工厂。为了指导大肠杆菌制造什么蛋白
质，我们可以在细胞内引入一个质粒----一种圆形的DNA片段。将质粒插入大肠杆菌的过程称为“转化”。一旦进入细胞，细菌的自然机制就会读取质粒DNA，并开始产生大量所需的蛋白质。大肠杆菌大约每20分钟分裂一次，所以只需要几个小时，就可以获得数十亿个细胞，每个细胞中含有数百万个蛋白质分子。接下来，我们打开细胞释放里面的蛋白质。一旦完成，就将Cas9从其他蛋白质以及DNA和RNA 中纯化出来。
有了cas9蛋白之后，我们需要制造RNA了。当我们把DNA模板、RNA聚合酶以及三磷酸核糖核苷酸加入试管后，等待几个小时，RNA聚合酶将产生数百万个特定RNA的拷贝。
接下来，我们将Cas9和crRNA与目标DNA(与crRNA匹配)结合起来，看看DNA是否被切割。它会被切割吗？很遗憾，试管中并没有发生任何反应。
在科学研究中，我们不可避免会遭遇失败。许多实验“失败”了，但我们可以从消极的结果中学到很多东西，关键是不要失望，而是要努力想清楚下一步该怎么做。为什么没有成功？是技术问题吗？也许
当我们分离Cas9时，我们“杀死”了它的切割活性？又或者是我们在试管中的反应条件不太对？也许Cas9不是切割病毒DNA的酶？或者是我们遗漏了什么元素？
或许，我们应该把研究的目标转向神秘的 tracrRNA？我们知道它参与了crRNA的加工，但它是否也能直接帮助 Cas9切割噬菌体DNA呢？我们回到实验室，再次设置我们的反应条件，现在有三种成分--Cas9酶、crRNA和tracrRNA。 我们惊异地发现，它成功了！利用 两种RNA（crRNA和tracrRNA)，Cas9现在可以切割DNA靶标。我们现在走在正确的轨道上。实验的结果使我们产生了这样一种模型：将Cas9酶、crRNA和tracrRNA聚集在一起形成了一个复合物，它会搜索、识别并从入侵的噬菌体中切割DNA的两条链。
但这并不代表着工作就此结束。如果我们将crRNA和tracrRNA结合成一个RNA，是否能允许Cas9切割 DNA？如果这样可行的话，那我们是否可以设计一种简单的“单导 RNA”来切割我们选择的任何DNA序列？
为什么要建立这样一个简单且序列特异性的DNA切割系统呢？原因就在于，当一条DNA链被切断时，它可以通过一种将新的DNA序列引入修复位点的方式进行修复。如果一个人能在一个活的有机体中做到这一点，那么他就有可能“重写”这个有机体基因组中的DNA序列。现在，让我们考虑这样一种情况，一个病人的血红蛋白基因中有一个单一的核苷酸突变，导致镰状细胞性贫血。也许我们可以纠正这一个核苷酸，产生一个正常的蛋白质，从而治愈这种疾病。
此时尽管在科学界存在着基因编辑技术，但它们价格昂贵、效率低下，当这种简单且序列特异性的DNA切割系统被开发出来后，无疑会有着强大的应用价值。然而，要使自然存在的三组分（Cas9酶、crRNA和tracrRNA）系统人工改造为两组分（Cas9和单个RNA）系统并不容易。
当我们在电子屏幕上观察crRNA和tracrRNA序列时，可以发现，将它们连接在一起可能并不是一个完全疯狂的想法，原因在于二者在端口处具有互补序列。研究人员决定添加一个由四个核苷酸组成的简单序列，将crRNA的一端与tracrRNA的一端连接在一起，以创建一个“单导RNA”。同时绘制如何修剪未连接的RNA的末端，从而使系统更简单，并测试不同长度的单导RNA，看看能达到多段。
我们要设置三组对照实验，第一组用Cas9靶向 DNA，不添加 RNA；第二组设置一个含有 Cas 9、tracrRNA和crRNA的DNA靶标；第三组使用含有Cas9的DNA靶标和含有与靶DNA互补片段的单导 RNA。那么如何判断Cas9是否切割了DNA呢？为了回答这个问题，我们使用了一种叫做琼脂糖凝胶电泳的技术，它可以分离两个不同大小的DNA分子。这种“凝胶”是一块长方形的琼脂糖板，具有硬果冻的稠度。琼脂糖被放置在一个充满咸溶液的腔室中，腔室的两端分别有一个正极和负极。然后将DNA移液到琼脂糖的槽孔中。施加来自电源的电流，并且带负电荷的DNA将通过多孔琼脂糖凝胶向正极迁移。一个较小的 DNA 分子会比一个较大的分子迁移得更快，因为它可以更容易地通过凝胶的网络。大约一个小时后，关闭电源，加入荧光DNA结合染料，以观察DNA在凝胶中的迁移位置。较小的 DNA 将结合较少的染料，因此也就不那么明亮。通常，特定大小的DNA分子会一起移动，并在凝胶上显示为单个条带。
结果表明，单独使用Cas 9时，DNA呈现预期大小的单个条带，表明其未被切割。大部分含有Cas9、tracrRNA和crRNA的DNA模板被切成两段，其大小加起来与原始目标DNA的大小相同，表明它是在一个位点被切割的。最后，将Cas9与sgRNA结合产生的裂解产物与crRNA和tracrRNA结合时产生的产物相同，这说明单导RNA的作用十分有效。
现在，我们要测试上述实验的原理是否普遍适用。为了得到答案，我们需要设计多个单导RNA，并测试它们是否都能够编程Cas 9来切割正确的DNA序列。为了做到这一点，我们从水母中提取了编码绿
色荧光蛋白（GFP）的基因序列，这是CRISPR系统从未进化到的目标。让人兴奋的是，实验在第一次尝试时就完全按照预期进行了----设计的RNA能够引导Cas9切割GFP基因，并且根据切割位点的位置预测DNA片段的大小。
现在已经毫无疑问了，Cas9是普遍可编程的，这将为其在真核细胞基因组编辑中的潜在应用铺平道路！它的出现打开了编辑人类基因组、治疗人类遗传疾病的大门，人类基因组中任何基因的DNA序列都可以被修改，可以完全破坏其功能，引入或纠正一个非常特定的突变，或者添加一个额外的序列。例如，在GFP的情况下，GFP的DNA序列可以附加到一个内源性基因的末端，使表达的蛋白荧光。这可能是有利的，因为与使用质粒相比，蛋白质将在细胞中以其自然水平产生，质粒倾向于以更高的水平产生蛋白质。这是它的美妙之处，适用 于各种各样的物种。许多被科学家认为无法进行基因改变的物种，现在都可以通过这项新技术进行基因操纵。
Cas9打开了潘多拉的盒子，这在生命科学中是前所未有的。除了基础研究之外，将Cas 9用于基因组编辑还引发了一些环境和伦理问题，这些问题需要科学家、伦理学家、环保主义者、政治家和公众之间的对话。争论的一个主要话题是生殖系编辑（编辑导致精子或卵子发生变化），其中对基因组所做的改变可以遗传给后代。人类应该修改自己的基因组吗？如果是，原因是什么？大多数科学家和伦理学家认为，人类基因组编辑可以用来纠正导致可怕的人类疾病的突变，比如囊性纤维化和镰状细胞性贫血。但这是否会导致人类其他特征的改变，并有可能改变人类的进化呢？另一个积极讨论的话题是利用基 因组工程开发“基因驱动”，即改变蚊子、苍蝇和其他携带疾病的生物的DNA以预防疾病的策略。我们应该何时以及如何改变其他物种的基因组？在我年幼的时候，我从来没有想过自己会积极参与到这样的浪潮中，但现在我已经深度参与其中。与许多其他科学家和非科学家一样，我觉得在道义上有义务帮助引导这项新技术朝着负责任和有用的方向发展。

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