【文献速递】IDT gBlocks Gene Fragments助力推进宫颈癌筛查研究

非诚勿扰孟非

宫颈癌是全球女性第四常见癌症。在过去的20年间，全球宫颈癌新发病例和死亡病例数在不断增加。
高危型人乳头瘤病毒 (HPV) 的持续感染是宫颈癌的主要原因。高危型HPV的DNA检测被广泛认可为宫颈癌筛查最敏感的方法，但由于检测成本高昂，在资源有限的地区难以普及。来自美国莱斯大学的Kundrod等人在Science Translational Medicine发表一篇名为“An integrated isothermal nucleic acid amplification test to detect HPV16 and HPV18 DNA in resource-limited settings”的文章，介绍了一种新的低成本且便携的HPV DNA检测方法，可以在资源匮乏的区域进行宫颈癌筛查。
✦ IDT产品亮点✦

研究人员使用了IDT gBlocks Gene Fragments作为HPV检测验证的标准品。IDT提供高质量、高保真的双链基因片段及基因，可用于各种工作流程及应用，如蛋白质进化、基因构建和抗体工程等。
IDT有三种不同的线性双链DNA产品可供选择，用户可以根据比较信息选择更合适的产品：


✦ 研究背景✦

在2020年，约60.4万名女性被诊断出患有宫颈癌，约34.2万名女性死于宫颈癌。在高收入国家中，通过细胞学检查和高危型HPV的DNA检测可以降低宫颈癌的发病率和死亡率。但在中低收入国家中，由于检测平台的成本、对实验室设备、技术人员及商业化检测的需求等障碍都阻碍了HPV DNA的检测。因此迫切需要一种成本低廉且操作便捷的宫颈癌筛查方法。为了填补宫颈癌现场检测的空白，并满足固定的检测需求，研究人员针对HPV16和HPV18（这两种病毒导致了全球约70%的宫颈癌）开发了一种新型检测手段。该检测依赖于重组酶聚合酶扩增 (RPA, Recombinase polymerase amplification) ，一种等温扩增技术，可以容忍传统的PCR过程中遇到的障碍，从而减少对核酸提取及纯化的需求。随后通过添加nfo酶进行RPA“nfo”检测。



Fig S1. RPA nfo检测原理。正向引物不带标签，探针和反向引物上带有两个不同的抗原标签。nfo酶会从nfo剪切位置截断，释放blocker，从而允许聚合酶延伸。正向和反向引物之间的扩增会产生只有1个抗原标签的未剪切产物。而探针和反向引物间的扩增会产生带有2个抗原标签的剪切产物，从而通过侧向层析 (lateral flow sandwich assays) 进行测定。
✦ 研究方法 ✦

研究人员在IDT埃德特合成了HPV 6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、72、82的E7基因gBlocks Gene Fragments，并从SiHa及HeLa细胞中提取了HPV DNA。研究人员使用上述的HPV DNA测试了RPA技术结合定制的NATflow兼容侧向层析条带的效果。并将完整检测流程与NATflow平台整合，分别在高/低收入地区进行测试。
✦ 研究结果 ✦

01-HPV16和HPV18 RPA检测的检测限低至每反应50-500拷贝，且可以有效区分HPV类型




Fig 1. HPV16和HPV18的多重RPA nfo反应的检测限及交叉反应性。(A) 使用商业化的侧向层析条带分别扩增和检测HPV16和HPV18的gBlocks合成DNA (HPV16：299bp，HPV18：328bp) 和SiHa (HPV16) 、Hela (HPV18) 细胞中提取的DNA。(B) 和A相同的条件下信号和背景的比值 (SBR) ，虚线为阳性阈值1.17。检测限为HPV16检测的50拷贝gBlocks合成DNA或SiHa细胞提取的500拷贝DNA，HPV18检测为50拷贝的gBlocks合成DNA及HeLa细胞提取DNA。(C) 和A相同条件下的琼脂糖电泳，HPV18检测在侧向层析的检测限更低的部分原因是切割产物相对非切割产物更容易形成。(D) HPV16和HPV18检测的特异性，竖直标签为HPV类型，水平标签为试验（HPV16或HPV18）及对照 (C) 。对每个列出的HPV类型，用106拷贝的gBlocks DNA进行扩增检验，只有HPV类型正确时才可以看到阳性信息（虚线框出）。
02-样本制备：氨基肽酶 (ACP) 对细胞裂解有效，且与RPA直接扩增兼容

在大多数宫颈癌筛查项目中，会使用宫颈阴道拭子直接收集细胞。使用ACP酶解方法需要的孵育时间最短，效果与超声法相当，且处理获得的粗细胞裂解物可以直接用于HPV16的RPA扩增。




Fig 2. 使用ACP进行样本制备。(A) qPCR检测SiHa细胞裂解后的HPV16 DNA起始量。NTC：非靶向对照，NLC：未裂解对照，Sonication：超声法。(B) 使用RPA检测法分别检测NTC和ACP法裂解后的SiHa细胞HPV16 DNA。+：阳性对照。

03-定制的NATflow兼容侧向层析检测条带与商业化的侧向层析条带表现相当。

研究人员将HPV扩增和侧向层析检测方法整合到了NATflow平台，发现每10微升反应中至少有1000目标拷贝时可以有效检测。定制NATflow兼容侧向层析在室温下可以在一个月内保持阳性。




Fig4. 对于SiHa和HeLa细胞提取的DNA，NATflow平台整合后的扩增和检测情况。

04-使用NATflow分别在高收入地区和低收入地区使用患者提供的宫颈阴道拭子样本分别检测HPV16和HPV18的DNA

在高收入地区，NATflow可以检测到大于500到1000拷贝的患者提供的宫颈阴道拭子中的HPV16及HPV18 DNA。在低收入地区，NATflow和商业化侧向层析条带对于HPV16的检测没有差异。而对HPV18的检测，商业化侧向层析条带的表现略优于NATflow。
✦ 结论 ✦

研究人员开发并评估了一种HPV16和HPV18的DNA现场检测试剂盒。研究人员表示该试剂盒集成了样本制备、等温扩增和侧流检测，可以大规模生产、自给自足且价格低廉，操作过程简单，仅需少量用户步骤。在高收入地区样本检测结果与参考HPV检测结果高度一致，在低收入地区样本检测结果和参考结果中度一致。
【参考文献】

Kundrod KA, Barra M, Wilkinson A, Smith CA, Natoli ME, Chang MM, Coole JB, Santhanaraj A, Lorenzoni C, Mavume C, Atif H, Montealegre JR, Scheurer ME, Castle PE, Schmeler KM, Richards-Kortum RR. An integrated isothermal nucleic acid amplification test to detect HPV16 and HPV18 DNA in resource-limited settings. Sci Transl Med. 2023 Jun 21;15(701):eabn4768. doi: 10.1126/scitranslmed.abn4768IF: 15.8 Q1 . Epub 2023 Jun 21. PMID: 37343083; PMCID: PMC10566637.
<hr/>【关于IDT埃德特】

Integrated DNA Technologies, Inc.（IDT埃德特）是丹纳赫集团（Danaher Corporation，纽约证交所代码：DHR）生命科学平台旗下的一家运营公司。IDT埃德特致力于面向生命科学界开发、生产并销售核酸产品，为学术与商业研究、农业、医疗诊断和药物开发等领域提供支持。IDT埃德特开发了多项针对基因组应用的专利技术，涵盖二代测序、CRISPR基因组编辑、合成生物学、数字 PCR以及RNA干扰。通过GMP服务，IDT埃德特生产的产品被科学家用于研究多种形式的癌症以及各类遗传性和传染性疾病。作为定制核酸生产领域的优秀厂商，IDT埃德特为超过130,000名生命科学研究人员提供服务。

IDT埃德特创立于1987年，其生产总部位于美国爱荷华州科拉维尔，并在美国加利福尼亚州圣地亚哥、美国北卡罗来纳州三角研究园、比利时鲁汶以及新加坡等地设有生产工厂。更多信息请关注“IDT埃德特”微信公众号或访问
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