Western blot实验准备：试剂配方

非诚勿扰孟非

蛋白免疫印迹（Western Blotting）是将电泳分离后的蛋白质从凝胶转移到NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定蛋白的一种蛋白质检测技术。
电泳液配方

• Glycine 18.80 g
  
• Tris 3.02 g
  
• SDS 1g
  
• 双蒸水 定容至1 L，提前1天配制，4℃保存
  

<hr/>转膜液配方

• Glycine 2.90 g
  
• Tris 5.80 g
  
• SDS 0/0.37/1g
  
• 甲醇 200 /0 ml
  
• ddH 2 O 定容至1 L
  
• 大蛋白（>100 kD）：
  
• SDS 1 g，甲醇0
  
• 小蛋白（<100kD）：
  
• SDS 0 g，甲醇200ml
  

<hr/>转膜过程中甲醇和SDS的作用

SDS的作用

SDS 跟蛋白质结合后，能使蛋白更容易从胶上转出来，但是它又能阻止蛋白与膜的结合。在转一些大蛋白时，因为大蛋白不容易从胶上转出，我们就要在转膜液里额外多加一些 SDS，帮助大蛋白从膜上转出。而小蛋白，靠 PAGE 胶里含有的那些 SDS 就足够了。过多的 SDS 还会影响电流，增加发热，从而影响某些蛋白的抗原性。所以需要根据情况控制 SDS的含量。
甲醇的作用

甲醇能破坏 SDS 与蛋白的结合，促使蛋白与膜结合。但是能破坏 PAGE 胶，使一些蛋白发生沉淀，从而影响到实验结果。所以也得严格控制量。
<hr/>TBST配方

• TBS buffer （pH7.5）
  
• Tris·Cl 12.114 g
  
• NaCl 9 g
  
• ddH 2 O 定容至1 L
  
• TBST：1 ml Tween 20→1 L TBS
  

<hr/>电泳时间

先选择80V恒压电泳，待溴酚兰迁移至分离胶后(约半小时)，提高电压至100-120V继续电泳，总时间一般2-3h，电泳至溴酚兰快跑出即可终止电泳，进行转膜。
转膜三明治的制作

2张10×10cm海绵、2张7.0×8.0cm的滤纸和1张7.5×8.5cm的PVDF膜（自己裁剪）。PVDF膜先置于100%甲醇中浸湿15s，然后移至超纯水中浸泡2min，最后转至转移液中至少平衡5min方可使用。
你学会了吗。

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