干货分享！只需5步，教你跑出漂亮的大分子WB图

生物科研实验室

若你正致力于研究高分子量蛋白（超过150KD），却困扰于难以获得理想的Western blot结果，那么本文一定是你想要的答案！
01凝胶选择是关键
三大最常见的凝胶类型：Tris-Glycine、Bis-Tris与Tris-Acetate。Tris-Glycine凝胶，pH值8.6，保质期短暂，运行中pH易升至9.5，引发蛋白降解与分辨率下降。Bis-Tris凝胶，pH值6.4，相较于Tris-Glycine，稳定性与保质期有所提升，但需添加抗氧化剂（如DTT）保持蛋白还原状态。Tris-Acetate凝胶，pH值7，针对大分子蛋白展现卓越分辨率。因此，针对大分子蛋白，我们推荐使用Tris-Acetate凝胶。02凝胶浓度同样关键，可使用梯度凝胶
选定Tris-Acetate凝胶后，还需注意以下几点。需知，凝胶浓度与孔径负相关：浓度越低，孔径越大。大分子蛋白更易通过大孔径，故推荐使用低浓度凝胶，如7%。梯度凝胶可作为优选，尤其适合新样本探索。尽管自制梯度凝胶操作复杂，需专用装置，但市面上已有多种预制梯度凝胶，覆盖不同范围，极大简化了实验流程。
03优化转移Buffer：增SDS，减甲醇
转移Buffer的配方对实验至关重要。甲醇易导至大分子蛋白沉淀，因此应降低其在转移Buffer中的比例至10%或更低，以预防此现象。同时，为进一步保障蛋白不沉淀，建议将SDS添加至终浓度0.1%。SDS能为蛋白均匀附加负电荷，促进其从凝胶向膜的有效转移。04膜材选择需谨慎
膜材通常包括PVDF膜与NC膜，针对大分子蛋白，PVDF膜更为适宜。
如前所述，甲醇易使大分子蛋白沉淀，而PVDF膜的使用无需在转移Buffer中添加甲醇，从而提高了目标蛋白的转印效率。
PVDF膜孔径多样，以0.2μm和0.45μm最为常见。与凝胶原理相似，大蛋白相较于小蛋白更易穿透大孔径。对于多数蛋白质（>20kDa），推荐使用0.45μm膜进行转移，尽量避免使用0.2μm孔径的膜。05延长转印时长
选定合适的凝胶、转印膜及转移buffer后，转印步骤随即启动。尽管半干转以其速度与便捷性著称，却非大分子蛋白的理想选择。鉴于此，试剂君倾向于推荐湿转法，特别是针对大分子蛋白，其转移过程较为缓慢，建议采用350-400 mA电流转印90分钟，或在4°C条件下以40 mA电流转印过夜。
有实践者证实，对于接近200 KDa的蛋白（例如EGFR），半干转同样能取得良好效果。更有观点指出，即便是接近300 KDa的庞大蛋白如mTOR，通过优化半干转条件（例如，遵循仪器预设程序进行一次转印，中间暂停以冷却，再继续转印），亦能成功获取结果。
因此，湿转与半干转的选择可依据个人经验而定，但关键在于必须适当延长转印时间。
小贴士
针对PVDF膜封闭，BSA并非最佳选择，因其效果欠佳。因此，试剂君推荐使用0.5%酪蛋白（Casein）作为封闭液。
具体操作步骤如下：将酪蛋白融入缓冲液中，置于加热板上加热至80℃或直至完全溶解，不要将溶液煮沸。使用前需冷却至25-40℃。
在整个检测过程中，务必保持膜面湿润。如果膜部分变干，可让膜完全干掉后，以甲醇重新润湿，再浸入缓冲液中，后续操作。